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Polymerase-Kettenreaktion
Die PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien zum Beispiel für die Erkennung von Erbkrankheiten und Virusinfektionen, für das Erstellen und …
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Grundidee und Bedeutung
Die Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR, ist eine Methode zur in vitro-Vervielfältigung von Erbsubstanz, also Desoxyribonukleinsäure (DNA). In vitro bedeutet, dass die Reaktion außerhalb eines lebenden Organismus im Labor stattfindet. Der Name „Kettenreaktion“ beschreibt, dass die Produkte eines Zyklus als Ausgangsstoffe für den nächsten Zyklus dienen. Dadurch kann ein bestimmter DNA-Abschnitt exponentiell vervielfältigt werden.
Bei der klassischen PCR wird die Reaktion durch ein Temperaturprogramm gesteuert. Eine Weiterentwicklung ist die isotherme DNA-Amplifikation, bei der die Vervielfältigung kontinuierlich bei konstanter Temperatur abläuft. Die PCR gehört zu den wichtigsten Methoden der modernen Molekularbiologie. Sie wird unter anderem zum Nachweis von Erbkrankheiten und Virusinfektionen, für genetische Fingerabdrücke, für das Klonieren von Genen und für Abstammungsgutachten eingesetzt. Im direkten Erregernachweis gilt sie als die empfindlichste und zuverlässigste Labormethode.
Entwickelt wurde die PCR 1985 von Kary Mullis; 1993 erhielt er dafür den Nobelpreis für Chemie. Eine wichtige technische Verbesserung war die Einführung thermostabiler DNA-Polymerasen. Diese Enzyme bleiben auch bei Temperaturen nahe 100 °C aktiv. Besonders verbreitet wurde die Taq-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Ihr Nachteil ist, dass sie gelegentlich Kopierfehler verursacht. Polymerasen wie Pwo und Pfu aus Archaea besitzen dagegen einen Korrekturmechanismus, der die Zahl solcher Mutationen deutlich senkt.
Prinzip, Bestandteile und Geräte
Die PCR vervielfältigt einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs. Dieser Zielbereich heißt Amplicon; die entstehenden Produkte heißen Amplifikate. Es kann sich um ein ganzes Gen, einen Teil eines Gens oder auch um nichtcodierende DNA-Sequenzen handeln. Eine Standard-PCR kann DNA-Fragmente bis etwa dreitausend Basenpaare, also 3 kbp, kopieren. Mit speziellen Polymerase-Gemischen, weiteren Zusätzen und optimalen Bedingungen sind auch Fragmente von über 20–40 kbp möglich. Das ist immer noch kurz im Vergleich zur chromosomalen DNA: Eine menschliche Zelle enthält etwa drei Milliarden Basenpaare pro haploidem Genom.
Für eine PCR braucht man mehrere Grundbestandteile: die Original-DNA als Template, also Vorlage; zwei Primer, die auf den beiden Einzelsträngen den Startpunkt der DNA-Synthese festlegen; eine hitzestabile DNA-Polymerase wie Taq-Polymerase; Desoxyribonukleosidtriphosphate als Bausteine des neuen DNA-Strangs; Mg²⁺-Ionen, die für die Funktion der Polymerase wichtig sind; und Pufferlösungen, die eine passende chemische Umgebung schaffen.
Die Reaktion läuft meist in kleinen Reaktionsgefäßen mit 10–200 µl Volumen ab. Ein Thermocycler erhitzt und kühlt die Gefäße sehr genau auf die jeweils benötigte Temperatur. Moderne Geräte besitzen einen beheizten Deckel von über 100 °C, damit sich kein störendes Kondensat bildet. Je nach Gerät können einzelne Reaktionsgefäße, zusammenhängende Gefäßstreifen oder PCR-Platten mit bis zu 96 Ansätzen zu 200 µl oder 384 Ansätzen zu je 50 µl verwendet werden.
Ablauf der Reaktion
Eine PCR besteht meist aus etwa 20–50 Zyklen, in der Praxis häufig aus etwa 30 Zyklen. Jeder Zyklus hat drei Hauptschritte.
Zuerst erfolgt die Denaturierung: Die doppelsträngige DNA wird auf 94–96 °C erhitzt. Dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden DNA-Strängen gelöst, sodass Einzelstränge entstehen. Im ersten Zyklus wird oft länger erhitzt, damit Ausgangs-DNA und Primer sicher getrennt sind. Manche Hot-Start-Polymerasen müssen durch eine längere Anfangserhitzung von bis zu 15 Minuten aktiviert werden.
Danach folgt die Primerhybridisierung, auch Annealing genannt. Die Temperatur wird für etwa 30 Sekunden abgesenkt, damit die Primer spezifisch an die passenden Stellen der DNA binden können. Die passende Temperatur hängt von Länge und Sequenz der Primer ab. Ist sie zu niedrig, können Primer auch an unpassende Sequenzen binden und unspezifische Produkte, sogenannte „Geisterbanden“, erzeugen. Ist sie zu hoch, binden die Primer schlecht oder gar nicht. Meist liegt die Annealing-Temperatur 5–10 °C unter dem Schmelzpunkt der Primersequenzen, häufig bei 55 bis 65 °C.
Im dritten Schritt, der Elongation oder Verlängerung, ergänzt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden. Sie beginnt am 3'-Ende des Primers und verlängert den neuen Strang in 5'→3'-Richtung. Die Temperatur liegt je nach Polymerase meist bei 68–72 °C. Bei Taq-Polymerase dauert dieser Schritt ungefähr 30 Sekunden je 500 Basenpaare.
Im Idealfall entstehen ab dem dritten Zyklus doppeltsträngige PCR-Produkte in der richtigen Länge. Diese gewünschten Produkte vermehren sich exponentiell, weil sie selbst wieder als Vorlage dienen. Unerwünschte längere Produkte steigen dagegen nur linear an. In der Praxis können besonders in späten Zyklen auch kürzere oder falsche Fragmente entstehen, etwa durch Fehlpaarungen der Primer.
Nachweis, Optimierung und Varianten
PCR-Produkte können mit Agarose-Gelelektrophorese anhand ihrer Größe identifiziert werden. Dabei wird DNA in ein Agarose-Gel eingebracht und eine elektrische Spannung angelegt. Kürzere DNA-Stränge wandern schneller zum Pluspol als längere. Durch Vergleich mit einer DNA-Leiter, die Fragmente bekannter Größe enthält, lässt sich die Länge des PCR-Produkts bestimmen. Wenn die PCR vor allem quantitativ ausgewertet werden soll, eignen sich Real Time PCR oder Digital PCR besser.
Zur PCR-Optimierung können verschiedene Methoden genutzt werden, um die Menge der gebildeten DNA zu erhöhen oder Hemmstoffe der Reaktion zu beseitigen. Viele Varianten der klassischen PCR wurden für besondere Aufgaben entwickelt.
Wichtige Varianten sind zum Beispiel die quantitative Echtzeit-PCR, kurz qPCR oder real-time PCR, bei der die DNA-Menge während jedes Zyklus über Fluoreszenz gemessen wird. Dadurch lässt sich bestimmen, wie viel Ziel-DNA ursprünglich vorhanden war. Bei der Reverse-Transkriptase-PCR, kurz RT-PCR, wird RNA zunächst mit einer reversen Transkriptase in DNA umgeschrieben und dann vervielfältigt; in Kombination mit qPCR heißt die Methode qRT-PCR. Die Digital PCR verteilt stark verdünnte DNA auf sehr viele winzige Reaktionsgefäße und zählt aus, in welchen Gefäßen eine Reaktion stattgefunden hat. Multiplex-PCR verwendet mehrere Primerpaare gleichzeitig, um ein Gen oder mehrere Gene in einer Reaktion zu untersuchen. Nested PCR nutzt zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen und erhöht dadurch die Spezifität, besonders wenn nur sehr wenig Ziel-DNA vorhanden ist. Touchdown-PCR beginnt mit einer hohen Annealing-Temperatur und senkt sie in späteren Zyklen, um unspezifische Produkte zu vermeiden.
Anwendungen in Forschung und Medizin
In der Forschung wird PCR zum Klonieren von Genen genutzt. Dabei wird ein Gen aus einem Organismus vervielfältigt und in einen Vektor eingesetzt, zum Beispiel in ein Plasmid, also ein ringförmiges DNA-Molekül. Danach kann die DNA in einen anderen Organismus übertragen werden, um das Gen oder sein Produkt zu untersuchen. Die Expression eines klonierten Gens kann auch dazu dienen, nutzbare Proteine in großen Mengen herzustellen, etwa für Arzneimittel.
PCR wird außerdem für Mutagenese verwendet, also für gezielte oder zufällige Veränderungen der DNA-Sequenz. Bei der gezielten Mutagenese wird die gewünschte Mutation meist in einen Primer eingebaut. Bei zufälliger Mutagenese nutzt man fehleranfällige Polymerasen; Ort und Art der Mutationen müssen anschließend durch Sequenzierung bestimmt werden. Solche Verfahren helfen dabei, die Beziehung zwischen Struktur und Funktion eines Proteins oder Funktionen von Nukleinsäuren zu untersuchen.
Auch moderne DNA-Sequenzierung beruht auf PCR-Varianten. Die Illumina-Sequenzierung verwendet eine Festphasen-PCR, bei der DNA-Fragmente über Adaptersequenzen an einer Oberfläche fixiert und vervielfältigt werden. Andere Verfahren beruhen auf Emulsions-PCR, etwa SOLiD oder die Ion-Torrent-Sequenzierung.
In Medizin und Diagnostik verkürzt PCR die Suche nach Erbkrankheiten, weil verdächtige Gene gezielt vervielfältigt und anschließend sequenziert werden können. Virale Erkrankungen lassen sich nachweisen, indem Virus-DNA vervielfältigt wird; bei RNA-Viren wird die RNA zunächst in DNA umgeschrieben. Eine PCR kann schon kurz nach der Infektion positiv sein, oft Tage oder Wochen vor Symptomen. Quantitative PCR wird außerdem genutzt, um zum Beispiel die Viruslast bei einer bekannten HIV-Infektion zu bestimmen. Blutspendedienste setzen PCR auch in Reihenuntersuchungen ein, indem Proben zu Pools zusammengefasst werden, zum Beispiel 64 Einzelproben. Bei COVID-19 wird PCR unter anderem zur sicheren Ausschlussdiagnostik möglicherweise falsch-positiver Antigen-Schnelltests eingesetzt.
Weitere Einsatzgebiete
In der Forensik dient PCR zur Erstellung genetischer Fingerabdrücke. Ein genetischer Fingerabdruck ist ein individuelles DNA-Profil. Dafür können sehr kleine Spuren wie Blut, Sperma, Speichel, Hautzellen oder Haare mit anhaftenden Zellen untersucht werden. Die PCR vervielfältigt bestimmte nichtcodierende DNA-Abschnitte, die kurze Wiederholungssequenzen, sogenannte Tandemwiederholungen, enthalten. Die Zahl dieser Wiederholungen und damit die Länge der Abschnitte unterscheidet sich stark zwischen Individuen. Durch Untersuchung mehrerer solcher Abschnitte entsteht ein individuelles Muster von PCR-Produkten. Abstammungsgutachten und Vaterschaftstests beruhen ebenfalls auf diesem Prinzip.
In Paläontologie, biologischer Anthropologie und molekularer Phylogenie ist PCR wichtig, weil sie auch aus sehr kleinen DNA-Mengen ausreichend Material erzeugen kann. Das ist besonders bei alter oder fossiler DNA, sogenannter aDNA, bedeutend, die in der Natur oft nur noch in sehr geringen Mengen erhalten ist. Viele Erkenntnisse über aDNA und ausgestorbene Arten beruhen auf PCR.
In der Lebensmittelanalytik wird PCR eingesetzt, um Anforderungen von Handel und Lebensmittelüberwachung zu erfüllen und unlauteren Wettbewerb aufzuklären oder zu verhindern. Sie kann zum Beispiel Gewürze in komplexen Lebensmittelmatrizes identifizieren oder Varietäten bei Edelkakao wie Criollo und Forastero unterscheiden.
