Replikation

Grundprinzip und Bedeutung

Replikation oder Reduplikation ist die Vervielfältigung von Nukleinsäuremolekülen, den Trägern der Erbinformation von Zellen oder Viren. Sie kann ein ganzes Genom, einzelne Chromosomen oder nur DNA-Abschnitte betreffen. Vor einer Mitose wird die DNA gewöhnlich in der S-Phase des Zellzyklus verdoppelt, damit beide Tochterzellen die gleiche Erbinformation erhalten. In spezialisierten somatischen Zellen können einzelne Sequenzen jedoch verstärkt vervielfältigt werden (Amplifikation) oder unterrepliziert bleiben.

Die Replikation doppelsträngiger DNA ist semikonservativ: Die Doppelhelix wird in zwei Einzelstränge getrennt. Jeder alte Strang dient als Matrize, also als Vorlage, für einen neuen komplementären Strang. Dadurch enthalten die zwei entstandenen DNA-Doppelstränge jeweils einen vorbestehenden und einen neu synthetisierten Einzelstrang. Die Basenpaarung legt die Ergänzung fest: Adenin ↔ Thymin und Guanin ↔ Cytosin. Der Meselson-Stahl-Versuch belegte dieses Modell.

DNA-Polymerasen können neue Nukleotide nur an ein freies 3′-Ende anfügen. Sie synthetisieren daher stets in 5′→3′-Richtung, während sie die antiparallele Matrize in 3′→5′-Richtung ablesen. Viren nutzen wegen ihres fehlenden eigenen Stoffwechsels Ausgangsstoffe der Wirtszelle und teilweise deren Enzyme. Bei Retroviren wird RNA durch Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben und in das Wirtsgenom eingebaut.

Start, Replikationsgabel und Strangsynthese

Am Replikationsursprung, dem Origin, entwindet eine Topoisomerase die DNA und vermindert dabei Torsionsspannungen. Eine Helikase trennt die Doppelstränge, indem sie Wasserstoffbrücken zwischen den Basen löst. Einzelstrang-bindende Proteine stabilisieren die geöffneten Stränge. Eine Primase erzeugt kurze RNA-Primer; diese liefern das freie 3′-OH-Ende, das die DNA-Polymerase zum Start benötigt.

An einer Replikationsgabel entsteht der Leitstrang kontinuierlich in Richtung der wandernden Gabel. Der Folgestrang wird ebenfalls 5′→3′, aber entgegen der Gabelbewegung stückweise hergestellt. Diese Stücke heißen Okazaki-Fragmente. RNA-Primer werden entfernt, die Lücken mit DNA ergänzt und die Fragmente durch DNA-Ligase über Phosphodiesterbindungen zu einem durchgehenden Strang verbunden. Die Replikation heißt deshalb auch semidiskontinuierlich.

Damit Leit- und Folgestrang gleichzeitig bearbeitet werden können, bildet der Folgestrang eine Schlaufe; dies wird als Posaunen-Modell beschrieben. Bei Eukaryoten bindet Replikationsfaktor C (RFC) die Polymerase Pol δ über die Protein-Klammer PCNA an die Matrize. PCNA verhindert, dass Pol δ abfällt. Ein Replikon ist die elementare Replikationseinheit: Es besitzt meist einen Origin und zwei vom Origin entgegengesetzt laufende Gabeln. Prokaryoten und Plasmide besitzen meist ein Replikon, große eukaryotische Genome viele. Beim Menschen gibt es 40000 bis 80000 Origins, bei Saccharomyces cerevisiae etwa 350 und bei Escherichia coli einen. Der Fortschritt einer Gabel wurde bei Zellen des Chinesischen Hamsters und HeLa-Zellen auf höchstens 2,5 Mikrometer pro Minute geschätzt.

Replikation bei Prokaryoten

Prokaryotische DNA liegt häufig ringförmig und zusätzlich verdrillt als Supercoils vor. Topoisomerasen entspannen die DNA durch kontrollierte Einzel- oder Doppelstrangbrüche und schließen anschließend das Zucker-Phosphat-Gerüst wieder. Bei E. coli heißt die Topoisomerase II Gyrase.

Der Origin oriC von E. coli umfasst 245 Basenpaare und enthält AT-reiche Sequenzen mit der Consensus-Sequenz 5′-GATCTNTTNTTTT-3′ beziehungsweise 3′-CTAGANAANAAAA-5′. Aktiviertes DnaA bindet mit ATP an fünf 9 bp lange DnaA-Boxen; etwa 20 DnaA-Proteine lagern sich als Schleife an. IHF und FIS beugen die DNA. Die Öffnung beginnt an drei aufeinanderfolgenden, jeweils 13 bp langen AT-reichen Sequenzen. Die Helikase DnaB wird durch DnaC zum Origin geleitet, arbeitet unter ATP-Verbrauch in 5′-3′-Richtung und erzeugt zwei bidirektional auseinanderlaufende Gabeln. SSB-Proteine halten die Einzelstränge getrennt. Die Primase DnaG setzt einen unter Zellbedingungen etwa 10 Nukleotide langen RNA-Primer; der Komplex heißt Primosom.

In der Elongation synthetisiert DNA-Polymerase III die komplementären Stränge. Nach Entfernung der RNA-Primer durch RNase H oder DNA-Polymerase I ergänzt DNA-Polymerase I die DNA; DNA-Ligase verbindet die Fragmente. Die Polymerase besitzt unter anderem eine Polymerase-Domäne, eine DNA-Klammer und eine 5′-3′-Exonuklease-Domäne zur Korrekturlesefunktion.

Bei ringförmiger DNA liegen dem Origin gegenüber Terminationssequenzen. Das Protein Tus bindet dort und blockiert die Helikase DnaB, sodass unterschiedlich schnell laufende Gabeln kontrolliert enden. Die beiden replizierten DNA-Ringe bleiben zunächst an der terminalen Stelle verbunden und werden anschließend mithilfe einer Typ-I- oder Typ-II-Topoisomerase getrennt.

Besonderheiten eukaryotischer DNA

Bei Eukaryoten ist die DNA stärker verpackt, unter anderem durch Histon- und Nicht-Histon-Proteine, und sie liegt linear vor. Die Grundfunktionen der Replikation entsprechen denen bei Prokaryoten, aber es gibt viele Origins. Das verkürzt die Vervielfältigung großer Genome trotz geringerer Geschwindigkeit: Eukaryotische Polymerasen ergänzen etwa 50 bis 100 Nukleotide pro Sekunde, prokaryotische mehr als 1000. Die Replikationszeit liegt bei Prokaryoten im Bereich einiger Minuten, bei Eukaryoten bei mehreren Stunden.

Eukaryotische Origins besitzen keine spezielle Sequenz, sondern wahrscheinlich Consensus-Sequenzen oder Replikationszentren; sie werden auch ARS-Elemente genannt. Der Origin-Erkennungskomplex ORC rekrutiert Cdc6, Cdt1 und Helicase Loading Proteins. Anschließend binden MCM-Helikasen. Cycline geben das Signal, und trotz vieler Origins wird die Replikation nur einmal pro S-Phase initiiert. Pol α ist mit der Primase verbunden; Pol δ füllt nach der Primerentfernung Lücken und DNA-Ligasen verbinden die DNA-Stücke. Cohesin hält während der S-Phase Schwesterchromatiden zusammen; Separase löst es in der Anaphase.

An Telomeren, den Chromosomenenden, kann nach Entfernung des letzten RNA-Primers keine Lücke geschlossen werden. Deshalb verkürzen sich die Telomere am 5′-Ende beider Tochterstränge bei jeder Verdopplung. Telomerase, eine Reverse Transkriptase mit RNA-Matrize, kompensiert diesen Verlust in Keimbahnzellen, Stammzellen, Knochenmark und einigen Tumorzellen. Sie verlängert den Leitstrang, sodass der Folgestrang nach Priming ergänzt werden kann. Ohne ausreichende Telomerreproduktion können Chromosomenenden ungeschützt werden und genomische Instabilität entstehen.

Endoreplikation bezeichnet wiederholte DNA-Synthesen ohne anschließende Zellteilung. Bei Amplifikation werden bestimmte Sequenzen übermäßig repliziert: Chorion-Gene von Drosophila melanogaster werden in Follikelzellen sechzigfach amplifiziert. Unterreplikation schließt bestimmte Sequenzen aus; in polytänen Chromosomen von D. melanogaster bleiben Gabeln in 20 % ihrer Banden stecken. Bei Chromatin-Diminution oder Chromosomen-Elimination wird in bestimmten somatischen Zellen DNA reguliert entfernt.

Weitere Replikationsmechanismen

Die häufigste Form ist die bidirektionale Replikation: Von einem Origin laufen zwei Gabeln gleichzeitig in entgegengesetzte Richtungen. Sie vervielfältigt lineare Chromosomen des eukaryotischen Kerngenoms und bakterielle Genome.

Beim D-Loop-Prozess mancher Chloroplasten und Mitochondrien beginnt die Replikation in einer großen nicht-codierenden Region ringförmiger DNA. Ein Polymerasekomplex läuft nur in eine Richtung und bildet einen kurzen dritten Strang, die 7S-DNA. Diese dreisträngige Verdrängungsschlaufe heißt D-Loop. Hat der replizierte Strang mehr als zwei Drittel der ursprünglichen DNA verdrängt, löst er sich und wird unabhängig zur doppelsträngigen DNA repliziert.

Bei der Rolling-Circle-Replikation von Plasmiden und vielen zirkulären ssDNA-Viren wird einzelsträngige Nukleinsäure zunächst zum Doppelstrang ergänzt. Bei doppelsträngiger Nukleinsäure öffnet eine Endonuklease einen Strang. Von dessen 3′-OH-Ende aus verlängert ein Polymerasekomplex den Strang, während der ungeschnittene Ring Matrize bleibt. Der innere Strang kann wiederholt genutzt werden; dadurch entstehen hintereinanderliegende Duplikate, teilweise Concatamere, die anschließend zerlegt werden. Dieser Ablauf ist die verbreitetste Hypothese. Das Modell kommt beispielsweise bei der Konjugation zweier Bakterien vor, wenn ein Plasmid-Einzelstrang übertragen wird.