Denaturierung (Biochemie)

Grundprinzip

Denaturierung bezeichnet eine strukturelle Veränderung von Biopolymeren wie Proteinen oder Desoxyribonukleinsäure (DNS/DNA). Meist geht dabei die biologische Funktion verloren, obwohl die Primärstruktur erhalten bleibt. Primärstruktur bedeutet die Reihenfolge der Bausteine, also bei Proteinen die Aminosäuren und bei Nukleinsäuren die Nukleotide. Ausgelöst wird Denaturierung durch physikalische oder chemische Einflüsse.

Bei der Denaturierung werden nicht normalerweise die starken kovalenten Bindungen der Hauptkette gespalten. Stattdessen werden schwächere Wechselwirkungen gestört, zum Beispiel ionische, polare und Van-der-Waals-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Effekte. Dadurch verändert sich die räumliche Faltung eines Moleküls. Der Vorgang kann reversibel, also umkehrbar, oder irreversibel, also unumkehrbar, sein. Der Umkehrvorgang heißt Renaturierung. Ein Beispiel für reversible Denaturierung ist DNA, die beim Erhitzen in Einzelstränge getrennt wird und beim Abkühlen wieder zusammenfinden kann. Ein Beispiel für irreversible Denaturierung ist ein gekochtes Ei, das durch Abkühlen nicht wieder roh wird.

Strukturänderungen in Biopolymeren lassen sich im Labor unter anderem mit FTIR, dualer Polarisationsinterferometrie, Circulardichroismus, QCM-D, Kryoelektronenmikroskopie, STED-Mikroskopie, SMLM-Mikroskopie, NMR-Spektroskopie und multiparametrischer Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie messen.

Proteine und Nukleinsäuren

Bei Proteinen verändert Denaturierung die Proteinfaltung, also Sekundärstruktur, Tertiärstruktur und eventuell Quartärstruktur. Die Reihenfolge der Aminosäuren bleibt erhalten. Ausnahmen betreffen Disulfidbrücken: Sie können, besonders im Labor durch Reduktion mit Sulfhydrylen, gespalten werden. Die Denaturierung führt meist dazu, dass Proteine ihre native Konfiguration verlieren. Nativ bedeutet hier die ursprüngliche, funktionsfähige räumliche Form. Dadurch werden Proteine in der Regel inaktiviert; sie können ihre biologische Funktion kaum noch oder gar nicht mehr erfüllen. Ausgenommen sind intrinsisch unstrukturierte Proteine.

Typische Folgen bei Proteinen sind eine geringere Löslichkeit, die Bildung von Proteinaggregaten und bei höheren Konzentrationen sichtbare Verklumpung. Außerdem steigt oft die Empfindlichkeit gegenüber Proteasen, also proteinabbauenden Enzymen. Weil viele Proteine renaturierbar sind, wurde im Anfinsen-Dogma formuliert, dass die native Form meist den energetisch günstigsten Zustand darstellt.

Bei Nukleinsäuren wie DNA und RNA beruhen wichtige Strukturen auf Basenpaarung, also Wasserstoffbrücken zwischen Nukleotiden. Solche Paarungen können innerhalb einer Kette auftreten, zum Beispiel bei tRNA, oder zwischen zwei Ketten, zum Beispiel in der DNA-Doppelhelix. Bei der Denaturierung werden diese Wasserstoffbrücken reversibel gelöst. Doppelsträngige DNA oder RNA wird dadurch in Einzelstränge getrennt; beim Abkühlen können passende Stränge wieder hybridisieren, also sich erneut über Basenpaarung aneinanderlagern.

Physikalische Auslöser

Zu den physikalischen Einflüssen gehören vor allem Hitze und Strahlung, außerdem hoher Druck, starkes Rühren, Schütteln, Ultraschall und Grenzflächenabsorption. Bei der Hitzedenaturierung wird durch Temperaturerhöhung die Molekülstruktur verändert. Meist bleiben kovalente Bindungen und damit die Primärstruktur erhalten, während Wasserstoffbrücken gebrochen oder neu gebildet werden. Bei Proteinen verändert sich dadurch häufig die Tertiärstruktur. Die biologische Aktivität nimmt ab oder geht verloren, und die Löslichkeit sinkt; sichtbar wird das als Ausflocken oder Gerinnung.

Die Temperatur, bei der Proteine zu denaturieren beginnen, hängt vom Aufbau und vom Organismus ab. Enzyme hyper-thermophiler Archaeen müssen Temperaturen weit über 80 °C aushalten. In leicht saurer Lösung wird Denaturierung durch Erhitzen verstärkt. Thermische Denaturierung von Proteinen erfolgt meist in einem relativ engen Temperaturbereich; deshalb wurde eine kooperative Entfaltung vermutet, bei der eine Entfaltung weitere begünstigt. Beim Autoklavieren werden Krankheitserreger auf Gegenständen inaktiviert, indem lebenswichtige Biopolymere denaturieren. Dafür muss eine Temperatur deutlich über 100 °C bei erhöhtem Druck über eine vorgegebene Zeit eingehalten werden.

Nukleinsäuren denaturieren in einem engen Temperaturintervall, dem „Schmelzpunkt“, meist oberhalb von 80 °C. In der PCR wird DNA bei etwa 95 °C denaturiert. Danach folgt das Annealing, bei dem Primer anlagern; die Annealing-Temperatur liegt normalerweise 2–3 °C unter dem jeweiligen Schmelzpunkt der Primer, meistens bei 50 bis 65 °C. Anschließend vervollständigt eine thermostabile DNA-Polymerase, etwa Taq-Polymerase, die Stränge bei 68 bis 72 °C. Dieser Zyklus wird etwa 25 bis 50 Mal wiederholt. Bei einer Denaturierung nimmt die Extinktion von DNA bei 260 nm um etwa 40 % zu.

Druck beeinflusst vor allem Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen, während die Sekundärstruktur kaum verändert werden kann. Da die Reaktionsvolumina bei der Proteinfaltung klein sind, braucht man meist mehrere 1000 bar. In der Lebensmitteltechnik wird Hochdruckpasteurisierung genutzt, um Mikroorganismen und Enzyme zu inaktivieren und Qualitätsverluste durch Hitze zu vermeiden.

Langwellige elektromagnetische Strahlung wie Infrarot, Mikrowellen und Radiowellen kann für sich genommen keine Denaturierung hervorrufen, aber durch Erwärmung eine Hitzedenaturierung auslösen. Ionisierende Strahlung wie Ultraviolett-Strahlung mit Einschränkungen, Gamma- und Röntgenstrahlung kann zusätzlich kovalente Bindungen aufbrechen und DNA-Schäden wie Kettenbrüche verursachen. Ein Sievert Gammastrahlung entspricht einem Joule Energie pro Kilogramm bestrahlter Masse und reicht bereits für akute Symptome der Strahlenkrankheit. Eine Äquivalentdosis von vier Kilosievert ist für alle bekannten höheren Tiere tödlich. Bestrahlung kann aber auch genutzt werden, um Lebensmittel keimfrei zu machen; die Lebensmittel werden dadurch nicht selbst strahlend.

Chemische Auslöser

Chemische Denaturierung kann durch Säuren, Basen, Salze wie Guanidiniumsalze, Detergentien, Harnstoff, organische Lösungsmittel oder Schwermetalle ausgelöst werden. Schwermetallionen können Komplexe mit Aminosäureresten bilden und so die biologisch aktive Proteinstruktur verändern.

Proteine besitzen je nach natürlicher Umgebung ein pH-Optimum, also einen pH-Bereich, in dem sie besonders stabil und aktiv sind. Bei Säuredenaturierung, zum Beispiel mit 40 % (V/V) Essigsäure, kommt es zu Ladungsverschiebungen. Säuren geben Protonen (H+) ab; dadurch verändern sich Ladungen, Wasserstoffbrückenbindungen können zerstört werden, und gleich positive Ladungen stoßen sich ab. Außerdem werden Carboxylatgruppen (COO−) der Aminosäuren Aspartat und Glutamat zu Carboxygruppen -COOH protoniert, wodurch frühere negative Ladungen verschwinden. Laugen wirken ebenfalls über Ladungsänderungen: Aminogruppen von Lysin oder Arginin werden deprotoniert, Carbonsäuregruppen zu Carboxylaten deprotoniert, Wasserstoffbrücken können zerstört werden, und mehr negative Ladungen stoßen sich ab. Bei Säure- oder Laugendenaturierung kann zugleich Hydrolyse auftreten. Wichtig ist auch der isoelektrische Punkt (pI): Dort ist ein Protein in der Nettoladung ungeladen und fällt leicht aus der Lösung aus.

Chaotrope wie bestimmte Salze, Formamid, Dimethylformamid, Guanidiniumsalze, Natriumsalicylat, Sulfoxid, Dimethylsulfoxid (DMSO), Natriumhydroxid, Alkohole, Propylenglykol und Harnstoff beeinflussen hydrophobe Effekte und können denaturieren. Je nach Stoff kann der Einfluss auch in Richtung Renaturierung gehen; bei Ausfällung spricht man von Einsalzen und Aussalzen. Der relative Einfluss salzbildender Anionen und Kationen wird durch die Hofmeister-Reihe beschrieben. DNA wird zum Beispiel durch Formamid (70 % V/V), Guanidiniumsalze (6 M), DMSO (60 % V/V), Natriumhydroxid (1 M) oder Harnstoff (6 M) denaturiert, meist zusammen mit Wärme; bei doppelsträngiger DNA sinkt dabei die Schmelztemperatur.

Detergentien, also bestimmte Tenside, können Proteine denaturieren, weil sie sich anlagern und das Protein linearisieren. Ionische Detergentien wirken besonders stark; eine einprozentige Lösung von Natriumlaurylsulfat (SDS) denaturiert bei Raumtemperatur bereits die meisten Proteine. SDS-Denaturierung wird bei der Probenvorbereitung zur SDS-PAGE verwendet. Ethanol und andere wasserlösliche organische Lösungsmittel stören Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen. 50- bis 70-prozentiges Ethanol denaturiert die meisten Proteine. Höherprozentige Alkohole wie Ethanol oder Isopropanol können desinfizieren, weil sie Membranproteine denaturieren, Membranlipide herauslösen und behüllten Viren ihre Lipidhülle nehmen.

Auch reines Wasser kann unter bestimmten Bedingungen denaturierend wirken: Werden Salze und kleine Moleküle durch Dialyse gegen bidestilliertes Wasser entfernt, können besonders große Proteine selektiv und reversibel ausfallen. Molekülmarkierungen, Fixierungslösungen, Gerbstoffe, kovalente Vernetzer wie Formaldehyd, Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd sowie Schwermetallionen können Proteine verändern oder in einer nicht-nativen Konformation fixieren, sodass Funktionen verloren gehen.

Renaturierung und Abgrenzung

Renaturierung ist die Rückkehr eines denaturierten Moleküls in seine native Form. Bei Proteinen ist sie wichtig, wenn nach der Aufreinigung aus einem Proteingemisch die biologische Aktivität gemessen werden soll. Sie gelingt nur bei Proteinen, deren native Konformation unter isotonischen Bedingungen zugleich der energetisch günstigste Zustand ist; bei metastabilen Proteinen gelingt sie nicht. Nach chemischer Denaturierung kann Renaturierung durch langsame Verdünnung des Denaturierungsmittels erreicht werden, zusammen mit der Wiederherstellung von Cofaktoren und einer isotonischen Umgebung. Teilweise werden weitere Zusätze verwendet. Bei Nukleinsäuren hybridisieren Einzelstränge nach thermischer Denaturierung wieder, wenn die Temperatur gesenkt wird. Die Geschwindigkeit der Renaturierung der Basenpaarung steigt mit dem Anteil korrekter Basenpaarung.

Nicht jede Strukturänderung ist Denaturierung. Nicht dazu gezählt werden durch Proteine vermittelte Strukturänderungen, etwa durch Enzyme synthetisierte, umgewandelte oder abgebaute Moleküle sowie Aktivierungs- und Deaktivierungsreaktionen. Ein Beispiel ist Milchprotein, das durch Lab-Enzyme koaguliert. Auch Konformationsänderungen durch Chaperone oder Prionen werden nicht als Denaturierung bezeichnet.

Wenn bei sehr hoher Temperatur kovalente Bindungen gespalten werden und Kettenbrüche entstehen, verändert sich die Primärstruktur; das zählt nicht zur Denaturierung, sondern zu gewöhnlichen chemischen Reaktionen. Ebenso können Säuren und Laugen bei hohen Konzentrationen und Reaktionstemperaturen durch Hydrolyse kovalente Bindungen spalten. Ein Grenzfall ist die Spaltung von Disulfidbrücken zwischen zwei Proteinsträngen: Zwar wird eine kovalente Bindung gelöst, aber die Aminosäuresequenz jedes einzelnen Strangs bleibt erhalten. Deshalb zählt eine prinzipiell reversible reduktive Spaltung von Disulfidbrücken zu den Denaturierungen.

Bedeutung in Natur und Technik

In Lebewesen kommt Denaturierung kontrolliert vor. Proteine werden in Zellen teilweise vor einem Membrantransport durch Chaperone entfaltet und falten sich anschließend wieder zurück. Bei DNA wird die Basenpaarung durch verschiedene DNA-bindende Proteine abschnittsweise aufgehoben, zum Beispiel bei Replikation und Transkription. Der Ort, an dem die Denaturierung beginnt, heißt Denaturierungsblase und wird im Poland-Scheraga-Modell beschrieben; DNA-Sequenz, Steifigkeit und Torsion sind darin jedoch nicht einbezogen. Die Lebensdauer einer Denaturierungsblase liegt zwischen einer Mikrosekunde und einer Millisekunde. Bei Tieren findet Denaturierung von Proteinen auch im Magen statt.

Technisch wird Denaturierung vielfach genutzt. In der Lebensmittelherstellung spielt sie beim Garen sowie bei der Herstellung von Panir oder Tofu eine Rolle. Durch Denaturierung beim Garen wird die Verdauung erleichtert; außerdem werden Mikroorganismen abgetötet und Viren inaktiviert. Desinfektion und teilweise Lebensmittelkonservierung, etwa durch Erhitzen oder Trocknen, nutzen die Denaturierung von Proteinen unerwünschter Mikroorganismen. Auch bei der Dauerwelle werden Haare denaturiert, um ihre Form zu verändern.

In der Biochemie dient Denaturierung dazu, Proteine zu entfalten, etwa chemisch bei der SDS-PAGE oder bei einer Proteinsequenzierung. Bindet ein Molekül an ein Protein, kann die Thermostabilität des Proteins steigen. Eine veränderte Denaturierungstemperatur kann mit einem Thermal Shift Assay gemessen werden und so eine Bindung nachweisen. Außerdem wird Denaturierung genutzt, um Enzyme bei der DNA-Extraktion oder RNA-Extraktion zu inaktivieren. Bei Nukleinsäuren verwenden PCR, DNA-Sequenzierung, Southern Blot, Northern Blot, in-situ-Hybridisierung und TGGE thermische Denaturierung; DGGE sowie Harnstoff- oder Formamid-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nutzen chemische Denaturierung.