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Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Biochemie - Labormethoden - AMBOSS Video
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Transkriptautomatisch erstellt · 39 Zeilen
- PCR Definition Die Polymerasekettenreaktion, kurz PCR, fuer
- Englisch polymerase chain reaction, ist eine Standardmethode der Molekularbiologie zur Vervielfaeltigung bestimmter Abschnitte doppelstraengiger DNA.
- Grundprinzip Die PCR beruht auf den Mechanismen der zellulaeren DNA-Replikation, wird aber in vitro durchgefuehrt.
- Das Grundprinzip ist dabei relativ simpel: Zuerst wird die doppelstraengige DNA, das so genannte Template, durch Hitze getrennt.
- Anschliessend synthetisiert eine DNA-Polymerase an jedem Einzelstrang in jeweils eine Richtung einen neuen Tochterstrang.
- Durch mehrfache Wiederholungen dieser Reaktionen wird ein spezifisch festgelegter DNA-Abschnitt exponentiell vervielfaeltigt, d.h. amplifiziert.
- Schon sehr kleine Mengen Ausgangs-DNA genuegen fuer die erfolgreiche Amplifikation des gewuenschten DNA-Abschnitts, da die Reaktion hoch spezifisch ablaeuft und eine sehr starke Vervielfaeltigung
- stattfindet. Detaillierter Ablauf Wie funktioniert der Reaktionsablauf im Detail?
- Zu Beginn des ersten Reaktionszyklus’ enthaelt der Reaktionsansatz folgendes: Doppelstraengige Ausgangs-DNA Vier verschiedene Nukleotide als Bausteine
- der DNA - das sind im Einzelnen Desoxyadenosintriphosphat Desoxyguanosintrisphosphat Desoxycytidintriphosphat und
- Desoxytymidintriphosphat DNA-Polymerase Hier verwendet man eine besondere, naemlich hitzestabile DNA-Polymerase.
- Sie ist auch nach dem Erhitzen auf hohe Temperaturen, die zur Denaturierung der DNA notwendig sind, noch funktionstuechtig.
- Solche Polymerasen stammen aus thermophilen Bakterien, z.B. Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus.
- Und schliesslich enthaelt der Reaktionsansatz noch zwei verschiedene sogenannte Primer. Das sind zwei kurze Oligonukleotide unterschiedlicher Nukleotidsequenz, die der DNA-Polymerase als
- Anknuepfungspunkt fuer das naechste passende Nukleotid dienen. Jeder der Primer begrenzt den einen der zu amplifizierenden DNA-Straenge in eine Richtung.
- Die Reaktion laeuft folgendermassen ab: Denaturierung Die Temperatur wird zuerst auf 90°C erhoeht,
- wodurch die DNA denaturiert und sich in Einzelstraenge auftrennt. Annealing Im naechsten Schritt wird die Temperatur auf
- die sogenannte Annealing-Temperatur von 50-60°C gesenkt. Jetzt koennen sich die Primer an die komplementaeren DNA-Sequenzen anlagern.
- Elongation In der nun folgenden Elongationsphase wird die Temperatur wieder auf ca.
- 70°C erhoeht. Dies ist die optimale Arbeitstemperatur der DNA-Polymerase, bei der sie die Nukleotide
- an die Primer anhaengt. Jeder Primer wird immer nur an seinem 3’OH-Ende verlaengert, dem Anknuepfungspunkt fuer das
- naechste, komplementaere Desoxyribonukleotid. Im ersten Reaktionszyklus erhaelt man noch zwei zu lange DNA-Straenge, die jeweils auf
- einer Seite ueber den gewuenschten Abschnitt hinausgehen. Das zu amplifizierende DNA-Fragment liegt jetzt insgesamt viermal vor.
- Es wurde also verdoppelt. Im zweiten Reaktionszyklus wird die Temperatur zuerst wieder auf 90°C erhoeht ((Denaturierung)).
- Die im Reaktionsgemisch vorhandenen doppelstraengigen DNA-Molekuele denaturieren. Im folgenden Schritt wird die Temperatur wieder auf die Annealing-Temperatur gesenkt.
- Die Primer lagern sich sequenzspezifisch an ((Annealing)). Im folgenden Schritt synthetisiert die DNA-Polymerase wieder die komplementaeren DNA-Straenge bei
- ihrer Arbeitstemperatur von ca. 70°C ((Elongation)).
- Nach dem zweiten Reaktionszyklus wurde wiederum die im Reaktionsgemisch vorhandene DNA verdoppelt. Jetzt finden sich auch schon zwei DNA-Molekuele, die in ihrer Laenge genau dem zu amplifizierenden
- DNA-Abschnitt entsprechen. Im dritten Reaktionszyklus verdoppelt sich die vorhandene DNA-Menge wieder nach dem gleichen
- Ablauf: Denaturierung, Annealing, Elongation. Mit jedem weiteren Zyklus der PCR erhaelt man immer mehr DNA-Molekuele, die dem gewuenschten
- Abschnitt auf der Ausgangs-DNA entsprechen. Im Verhaeltnis ist die Anzahl der anfaenglich noch zu langen DNA-Molekuele verschwindend
- gering, denn ihre Anzahl steigt nur linear an, wohingegen die Menge der Produkte mit der gewuenschten Laenge exponentiell waechst.
- Nach ca. 30 Zyklen wurde das durch die Wahl der Primer festgelegte DNA-Fragment je nach Effizienz
- der Reaktion um den Faktor 106 bis 1012 amplifiziert. Weitere Verwendung/Analyse Die amplifizierte DNA kann jetzt analysiert
- werden. Dazu wird diese meist in einer Gelelektrophorese sichtbar gemacht.
- So kann z.B. eine mittels PCR vervielfaeltigte Erreger-DNA nachgewiesen werden. Dank der hohen Spezifitaet der Reaktion ist es moeglich, auch schwer oder gar nicht kultivierbare
- Mikroorganismen nachzuweisen. Alternativ kann die DNA auch weiterverwendet und z.B. in ein Bakteriengenom transferiert
- werden. Diese gentechnische Methode wird verwendet, um bestimmte, therapeutisch eingesetzte Proteine
- herzustellen, z.B. rekombinantes Humaninsulin.
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