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Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ist in der Biochemie eine Methode zum Auftrennen von Molekülen, insbesondere von Proteinen und Nukleinsäuren.
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Grundprinzip der PAGE
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ist eine biochemische Methode zur Auftrennung von Molekülen, besonders von Proteinen und Nukleinsäuren. Ein Polyacrylamid-Gel bildet dabei ein Netzwerk mit Poren. Unter elektrischer Spannung wandern geladene Moleküle durch dieses Netzwerk und werden getrennt.
Wie gut die Trennung gelingt, hängt von Ladung, Größe, Molmasse und der Beschaffenheit des Trennmediums ab. Die Porengröße des Gels ist besonders wichtig: Für größere Moleküle wird eine niedrigere Acrylamidkonzentration benötigt als für kleinere Moleküle.
Aufbau und Porengröße des Gels
Das Gel entsteht durch radikalische Polymerisation von Acrylamid und N,N′-Methylenbisacrylamid, gewöhnlich im Verhältnis 37,5:1. Bisacrylamid vernetzt die sonst linearen Polyacrylamid-Ketten; dadurch entsteht ein starres Gel.
Der mittlere Porendurchmesser wird durch zwei Werte bestimmt: %T ist die gesamte Konzentration von Acrylamid und Bisacrylamid, %C die Bisacrylamidkonzentration. Die Porengröße ist umgekehrt proportional zu %T: Steigt %T, werden die Poren kleiner. Bei %C entstehen bei 5 % die kleinsten Poren; der Zusammenhang ist parabelförmig und hat dort seinen Tiefpunkt.
Das Gel besteht aus einem Trenngel und einer darüberliegenden, niedrigeren Schicht Sammelgel. Der pH-Wert des Puffers sowie die Konzentrationen von Acrylamid und Bisacrylamid bestimmen die Trenneigenschaften. Bei der diskontinuierlichen Elektrophorese werden für Sammel- und Trenngel verschiedene Puffer verwendet.
Herstellung des Gels
Die Mischung für das Trenngel wird mit Ammoniumperoxodisulfat (APS) als Radikalstarter und Tetramethylethylendiamin (TEMED) als Polymerisierungskatalysator versetzt. Sie wird zügig und blasenfrei zwischen zwei saubere, fettfreie Glasplatten gegossen. Abstandhalter halten die Platten etwa 1,5 mm auseinander.
Das Trenngel wird mit Wasser, Isopropanol oder Butanol überschichtet. Dies glättet die Gelgrenze und schließt Sauerstoff aus, weil Luftsauerstoff die für die Polymerisation nötigen Radikale abfangen kann. Nach vollständiger Polymerisation wird die Flüssigkeit entfernt. Dann wird das ebenfalls mit APS und TEMED versetzte Sammelgel aufpipettiert. Ein Kamm erzeugt Taschen für die Proben und wird nach dem Auspolymerisieren entfernt.
Riboflavin kann APS ersetzen. Mit hellem blau-violettem Licht lässt sich dann der Zeitpunkt der Polymerisation bestimmen. Unpolymerisiertes Acrylamid ist giftig, deshalb sind Handschuhe nötig; vollständig auspolymerisiertes Gel ist weitgehend gesundheitlich unbedenklich. Statt Bisacrylamid kann N,N′-Diallyltartardiamid verwendet werden. Dieses Gel lässt sich nach dem Trennlauf mit Natriumperiodatlösung durch Glycolspaltung auflösen, was die Untersuchung getrennter Stoffe erleichtert.
Durchführung und Sichtbarmachung
Das fertige Gel wird in eine Elektrophorese-Apparatur eingespannt. Die Proben kommen in die Taschen. Meist enthält eine Tasche eine Referenz, etwa einen Proteinstandard mit mehreren Proteinen bekannter Größe. Zusätzlich wird ein sichtbarer, negativ geladener Farbstoff wie Bromphenolblau zugesetzt.
Bei einer Spannung von 10 bis 20 V/cm Gellänge bei 1 mm Dicke werden die geladenen Moleküle durch das Polymer gezogen und getrennt. Der Lauf endet, wenn der Farbstoff das Gel durchlaufen hat. Proteinbanden werden anschließend durch Coomassiefärbung oder Silberfärbung sichtbar gemacht.
Einsatzbereiche und Varianten
Acrylamid-Gele eignen sich zur Trennung von Proteinen mit Molmassen zwischen 1 und 500 kDa. Varianten der PAGE sind Nativ-PAGE, SDS-PAGE, BAC-PAGE, CTAB-PAGE und Urea-PAGE.
Die Verbindung einer isoelektrischen Fokussierung oder einer BAC-PAGE mit einer SDS-PAGE heißt 2D-Gelelektrophorese. Als alternative Matrix mit deutlich größeren Porendurchmessern wird bei der Agarose-Gelelektrophorese Agarose verwendet.