SDS-PAGE

Grundprinzip und Eigenschaften

SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) ist eine Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Sie trennt Proteinmischungen in einem elektrischen Feld hauptsächlich nach der Molekülmasse. Das von Ulrich K. Laemmli entwickelte diskontinuierliche System trennt Proteine mit Molekülmassen zwischen 5 und 250 kDa gut.

Entscheidend ist SDS, ein anionisches Tensid (Detergens). Es bindet mit ungefähr 1,4 g SDS pro Gramm Protein, also etwa einem SDS-Molekül pro zwei Aminosäuren. Dadurch werden die Eigenladungen der Proteine weitgehend überdeckt; die Proteine erhalten eine annähernd konstante negative Ladungsverteilung. Zusammen mit dem üblichen Aufkochen denaturiert SDS die Proteine: Gefaltete Moleküle werden linearisiert. Daher hängt ihre Wanderung im Gel vor allem von der Kettenlänge und damit proportional von der Molekülmasse ab. Längere Proteine werden stärker zurückgehalten als kürzere.

SDS-Monomere binden über hydrophobe Wechselwirkungen an Proteine. Ab der kritischen Mizellenbildungskonzentration von 7 bis 10 Millimolar liegen SDS-Monomere und kugelförmige Mizellen gleichzeitig vor; eine Mizelle besteht dort aus etwa 62 SDS-Molekülen. Mizellen nehmen keine Proteine auf. Ab 0,1 Millimolar beginnt SDS Proteine zu entfalten, oberhalb von 1 mM werden die meisten denaturiert. Deshalb lassen sich Quartärstrukturen, also die Zusammenlagerung mehrerer Proteinuntereinheiten, meist nicht bestimmen. Ausnahmen sind kovalent quervernetzte oder SDS-resistente Proteinkomplexe; letztere können bei Raumtemperatur stabil erscheinen, werden aber durch Erhitzen denaturiert.

Als Alternativen mit kationischen Tensiden sind teilweise CTAB-PAGE und BAC-PAGE mit 16-BAC möglich.

Gel als Molekularsieb

Im elektrischen Feld wandern geladene Teilchen zum entgegengesetzt geladenen Pol. SDS-beladene Proteine sind negativ und bewegen sich daher zur Anode, dem Plus-Pol. Das ungeladene Polyacrylamid-Hydrogel wirkt zusätzlich als Sieb: Kleine Proteine passieren seine Poren leichter als große.

Das Gel entsteht durch radikalische Polymerisation von Acrylamid und N,N′-Methylenbisacrylamid, gewöhnlich im Verhältnis 37,5:1. Bisacrylamid vernetzt die sonst linearen Polyacrylamid-Ketten und macht das Gel stabil. Die Porengröße wird durch %T, die Gesamtkonzentration aus Acrylamid und Bisacrylamid, und %C, die Bisacrylamidkonzentration, bestimmt. Sie ist umgekehrt proportional zu %T: Höheres %T bedeutet kleinere Poren. Bei %C ergeben 5 % die kleinsten Poren; der Zusammenhang ist parabelförmig und hat bei 5 % seinen Vertex. Spaltbare Vernetzer wie N,N′-Diallyltartardiamid oder Bis-Acryloylcystamin können verwendet werden, wenn das Gel später wieder aufgelöst werden soll.

Ablauf der Trennung

Die SDS-PAGE umfasst Gelherstellung, Probenvorbereitung, Elektrophorese, Sichtbarmachung der Proteine und Auswertung des Bandenmusters.

Bei der diskontinuierlichen Methode besteht das Gel aus Sammelgel und Trenngel. Typisch sind 4 % V/V Acrylamid im Sammelgel und 10–12 % im Trenngel; das Sammelgel hat meist 4–6 %T und pH 6,8, das Trenngel 10–20 %T und pH 8,8. Acrylamid, Methylenbisacrylamid, Puffer, Wasser und SDS werden zwischen Glasplatten gegossen. TEMED und Ammoniumpersulfat (APS) starten die Polymerisation. Zuerst wird das Trenngel gegossen, danach das Sammelgel mit einem Probenkamm. Der Kamm hinterlässt Taschen für die Proben. Gradientengele, meist mit 4 bis 12 % Acrylamid, erweitern den trennbaren Molmassenbereich.

Für die Probe wird SDS-haltiger Probenpuffer im Überschuss zugegeben und fünf Minuten auf 95 °C erhitzt. Optional spalten reduzierende Thiole Disulfidbrücken, zum Beispiel β-Mercaptoethanol mit 5 % Volumenanteil, DTT mit 10 Millimolar oder DTE mit 10 Millimolar. Zusätzlich wird meist ein Größenmarker aus Proteinen bekannter Größe geladen; er erlaubt eine Größenabschätzung mit einer Genauigkeit von ± 10 %.

Bei meist etwa 100 Volt, entsprechend 10–20 V pro cm Gellänge, wandern die Proteine zur Anode. Die Laufzeit beträgt je nach Gel und Spannung eine halbe Stunde bis mehrere Stunden, unter bestimmten Bedingungen etwa zehn Minuten. Bromphenolblau markiert als kleiner anionischer Farbstoff die Laufmittelfront und zeigt an, wann der Lauf beendet werden sollte.

Beim häufigen TRIS-Glycin-Chlorid-System konzentrieren sich Proteine zunächst im Sammelgel. Dort laufen Chloridionen vor den Proteinen, während Glycin überwiegend neutral hinter ihnen bleibt. Im basischen Trenngel wird Glycin zum negativ geladenen Glycinat und überholt die Proteine. Dieser Wechsel an der Gelgrenze erzeugt den Stapelungseffekt: Die Proteinbanden werden schmaler und schärfer, bevor die eigentliche Trennung erfolgt. Für kleine Proteine und Peptide von 0,5 bis 50 kDa eignet sich das TRIS-Tricin-Puffersystem von Schägger und von Jagow.

Färbung, Auswertung und Molmasse

Nach der Trennung werden Proteine als Banden sichtbar gemacht, beispielsweise mit Coomassiefärbung, der am häufigsten verwendeten und einfach durchzuführenden Methode, oder mit Silberfärbung, die die höchste Sensitivität besitzt. Weitere Möglichkeiten sind Stains-all, Amidoschwarz 10 B, Fast Green FCF, fluoreszente Färbungen wie Epicocconon oder SYPRO Orange sowie der immunologische Nachweis im Western Blot. Fluoreszente Färbungen zeigen über etwa drei Zehnerpotenzen oberhalb der Nachweisgrenze eine vergleichsweise lineare Beziehung zwischen Farbintensität und Proteinmenge. Trichlorethanol kann bereits der Gellösung zugegeben werden; nach UV-Bestrahlung ist dann keine nachträgliche Färbung nötig.

Das Bandenmuster wird meist fotografiert oder gescannt. Breite, unscharfe Banden können bei Glykoproteinen entstehen, weil SDS an Glykosylierungen ungleichmäßig adsorbiert. Bei Membranproteinen kann eine Schweifbildung oberhalb der Bande auf zu wenig Detergens oder zu viel aufgetragenes Protein hinweisen. Mehr oder konzentrierterer Probenpuffer und eine geringere Proteinmenge können helfen. Eine halbkreisförmige Bande weist auf Überladung hin. Viele schwache oder ineinander übergehende Banden sprechen für geringe Reinheit; ein Schmier unterhalb einer gereinigten Proteinbande kann proteolytische Degradation anzeigen. Einzelne Banden können durch Gelextraktion oder Elektroelution zurückgewonnen werden.

Für eine genauere Molmassenbestimmung wird die relative Laufweite Rf beziehungsweise Rm bestimmt: Rf = Laufweite der Proteinbande / Laufweite der Proteinfront. Beide Laufweiten werden vom Beginn des Trenngels aus gemessen; die Proteinfront entspricht ungefähr der Bromphenolblau-Laufweite. Die Rf-Werte eines Größenmarkers werden halblogarithmisch gegen dessen bekannte Molmassen aufgetragen. Im linearen Bereich des Graphen lässt sich die Molmasse eines unbekannten Proteins durch Vergleich oder Regressionsanalyse bestimmen; Messungen erfolgen meist in Triplikaten. Glykosylierungen machen Banden unschärfer. Viele basische Aminosäuren, etwa bei Histonen, können die Molmasse überschätzen lassen oder die Einwanderung ins Gel verhindern; viele saure Aminosäuren können die Wanderung beschleunigen und die Molmasse unterschätzen lassen.

Anwendungen, Varianten und Grenzen

SDS-PAGE dient in der Biochemie zur schnellen, genauen und vergleichsweise kostengünstigen Trennung und Analyse von Proteinen. Wegen ihrer geringen Skalierbarkeit ist sie vor allem ein analytisches und weniger ein präparatives Verfahren für größere Proteinmengen. Zusammen mit einem Western Blot kann sie das Vorhandensein eines bestimmten Proteins in einer Mischung nachweisen. Posttranslationale Modifikationen können dabei eine Bandenverschiebung verursachen oder die Bindung eines Nachweisantikörpers verändern, sodass eine Bande erscheint oder verschwindet.

In der Protein-Massenspektrometrie wird SDS-PAGE häufig zur Probenvorbereitung eingesetzt, meist mit einem in-Gel-Verdau. Bei der Molmassenbestimmung ist sie etwas genauer als analytische Ultrazentrifugation, aber weniger genau als Massenspektrometrie oder – ohne Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen – die Berechnung aus der DNA-Sequenz. Medizinisch wird sie unter anderem bei HIV-Tests und Proteinurie eingesetzt: Beim HIV-Test werden getrennte HIV-Proteine im Western Blot mit HIV-spezifischen Antikörpern aus dem Blutserum nachgewiesen. Bei Proteinurie werden Mengen verschiedener Serumproteine im Urin beurteilt, etwa Albumin, Alpha-2-Makroglobulin und IgG.

Varianten sind die 2D-Gelelektrophorese, die eine isoelektrische Fokussierung oder BAC-PAGE mit SDS-PAGE kombiniert, und die Nativ-PAGE zum Erhalt der natürlichen Proteinfaltung. BAC-PAGE oder CTAB-PAGE können Membranproteine trennen; für größere Proteinkomplexe kann Agarose-Gelelektrophorese wie SDD-AGE verwendet werden. Enzyme sind teilweise durch Zymographie über ihre Aktivität nachweisbar.

Weil SDS Proteine denaturiert, sind bei erforderlichen nicht-denaturierenden Bedingungen Nativ-PAGE oder chromatographische Verfahren geeignet, etwa Affinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie mit photometrischer Mengenbestimmung. Auch Tangential-Flow-Filtration, Ultrafiltration, Pull-Down-Assays sowie die Ammoniumsulfat- oder Polyethylenglykol-Fällung können zur Trennung oder Reinigung dienen. Gefärbte Gele lassen sich nach der Dokumentation trocknen und archivieren; Proteine können später daraus extrahiert werden.