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Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine biochemische und molekularbiologische Methode, in der Nukleinsäure-Stränge (RNA oder DNA) durch eine …
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Methode und Zweck
Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine biochemische und molekularbiologische Methode. Sie trennt Nukleinsäure-Stränge, also RNA oder DNA, nach ihrer Größe. Dadurch können Größe und Masse einer Probe bestimmt werden: Man vergleicht sie mit DNA-Strängen bekannter Größe, einer DNA-Leiter.
Die Methode nutzt aus, dass die Anzahl der Basen oder Basenpaare proportional zur Kettenlänge und näherungsweise proportional zur jeweiligen Molmasse ist. Anhand der Position einer DNA- oder RNA-Bande im Vergleich zur DNA-Leiter lässt sich daher ihre Länge bestimmen.
Gel, Trennung und Sichtbarmachung
Agarosepulver wird kurz in einem Elektrophoresepuffer aufgekocht und gelöst, zum Beispiel in TRIS-Essigsäure-EDTA-Puffer (TAE-Puffer), TRIS-Borsäure-EDTA-Puffer (TBE-Puffer), Natriumborat-Puffer oder Lithiumborat-Puffer. Beim Abkühlen entsteht ein Gel: Kettenförmige Agarosemoleküle sind über Wasserstoffbrücken quervernetzt. Die Agarosekonzentration beträgt meist 0,5 bis 3 % (m/V). Eine höhere Konzentration führt zu kleineren Poren und zu einem festeren Gel.
Vor der Elektrophorese werden die Proben mit Probenpuffer versetzt. Dieser enthält anionische Farbstoffe, welche die Laufmittelfront markieren. Das Gel wirkt wie ein Sieb: Große Moleküle werden stärker zurückgehalten als kleine. Im elektrischen Feld wandern die negativ geladenen Nukleinsäure-Moleküle zum Pluspol durch die Gelmaschen. So werden die Stränge nach ihrer Größe aufgetrennt.
Zum Nachweis enthält das Gel bereits bei der Herstellung meist Ethidiumbromid, der Probenpuffer Kristallviolett, oder das Gel wird nach dem Lauf mit Methylenblau, Stains-all oder Ethidiumbromid gefärbt. Es entsteht ein nach Länge sortiertes Bandenmuster, das fotografisch dokumentiert werden kann. Bei Fluoreszenzfarbstoffen wie Ethidiumbromid sind oft UV-Licht und ein UV-Filter an der Kamera erforderlich. Soll die Nukleinsäure anschließend aus dem Gel zurückgewonnen werden, wird die UV-Bestrahlung möglichst kurz gehalten, um DNA-Schäden zu vermeiden.
Für kurze DNA-Sequenzen unter 500 bp werden meist stärker konzentrierte Agarosegele oder Polyacrylamidgele verwendet. Varianten sind der Electrophoretic Mobility Shift Assay und die Pulsed-Field-Gelelektrophorese.