2D-Gelelektrophorese

Grundprinzip und Bedeutung

Die zweidimensionale Gelelektrophorese (2D-Gelelektrophorese) ist eine analytische Methode der Biochemie, Molekularbiologie und Proteomik. Sie trennt komplexe Proteingemische, etwa Bakterienlysate, Zell- oder Gewebelysate und Körperflüssigkeiten, in einzelne Proteine. Dazu werden zwei zueinander orthogonale Trennungen kombiniert: zuerst die isoelektrische Fokussierung (IEF) nach dem isoelektrischen Punkt, danach die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach der Größe. Dadurch entsteht eine besonders hochauflösende Trennung.

Jeder Fleck im resultierenden Muster, ein Proteinspot, entspricht einer Sorte von Proteinmolekülen. Proteinmuster verändern sich abhängig von Umwelt und Zustand eines biologischen Systems. Deshalb lassen sie sich beispielsweise verwenden, um geschädigte mit gesunden oder optimal mit suboptimal gewachsenen Zellen zu unterscheiden, Krankheitsursachen zu untersuchen oder Medikamentenwirkungen auf molekularer Ebene zu erfassen. Wegen der komplexen Muster erfolgt die Auswertung meist mit spezieller Software.

Probe und erste Trennung

Die Proben werden möglichst unter identischen Bedingungen gewonnen und verarbeitet, damit keine zusätzlichen Einflüsse die Ergebnisse verfälschen. Sekretierte Proteine werden meist gefällt; intrazelluläre Proteine werden durch schonende Zerstörung der Zellstrukturen extrahiert und teilweise gereinigt. Da Proteine außerhalb ihrer natürlichen Umgebung zu Aggregation und Abbau durch Proteasen neigen, arbeitet man bei 4 °C und setzt in der Regel Harnstoff als Chaotrop, nichtionische Detergentien sowie proteasehemmende Stoffe zu.

In der IEF wandern Proteine in einem pH-Gradienten im elektrischen Feld. Saure und basische Aminosäurereste ändern je nach pH-Wert ihren Protonierungszustand und damit die Ladung des Proteins. Am isoelektrischen Punkt (pI) besitzt ein Protein eine Nettoladung von 0 und bleibt dort liegen. Diffundiert es in einen benachbarten pH-Bereich, wird es wieder geladen und vom elektrischen Feld zum pI zurückgeführt.

Bei immobilisierten pH-Gradienten (IPG) bilden einpolymerisierte Immobiline, Acrylamidderivate mit sauren oder basischen funktionellen Gruppen und definiertem pK-Wert, einen unveränderlichen pH-Gradienten. Bei Trägerampholyten erzeugen frei bewegliche synthetische Aminosäuren den Gradienten erst im elektrischen Feld; dieser ist jedoch zeitinstabil. Alternativ kann die erste Dimension mit einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung eines kationischen Detergens wie 16-BAC oder CTAB erfolgen.

Äquilibrierung und zweite Trennung

Nach der IEF wird der Gelstreifen äquilibriert. Zuerst reduzieren beispielsweise Mercaptoethanol oder Dithiothreitol Disulfidbrücken. Die entstandenen HS-Gruppen werden etwa mit Iodacetamid alkyliert, damit sie nicht erneut Disulfidgruppen bilden. Anschließend belädt Natriumdodecylsulfat (SDS), ein negativ geladenes Detergenz, die Proteine: Etwa ein SDS-Molekül bindet pro 3 Aminosäuren über hydrophobe Wechselwirkungen. Die Proteine werden dadurch vollständig entfaltet und linearisiert; ihre Eigenladung kann gegenüber den vielen gebundenen negativen SDS-Molekülen meist vernachlässigt werden.

Der IEF-Gelstreifen wird auf ein SDS-haltiges Polyacrylamidgel gelegt. In der zweiten Elektrophorese wandern die Proteine senkrecht zur ersten Dimension zur Anode. Das Gel bremst große Moleküle stärker als kleine: Kleine Proteine erreichen rasch die gegenüberliegende Gelkante, große wandern langsam. Der Lauf endet, wenn die kleinen Proteine den Gelrand erreichen; ein mitlaufender Farbstoff wie Bromphenolblau zeigt dies an. Danach wird das Muster mit Methanol oder Ethanol und Essigsäure fixiert. Die Proteine werden dabei denaturiert, das Tensid entfernt und die Proteine unlöslich, sodass Diffusion verhindert wird.

Markierung, Nachweis und Bildauswertung

Für die Untersuchung von Proteinsyntheserate oder Phosphorylierung können Zellen radioaktive Isotope einbauen, beispielsweise ^{35}S in Proteine oder ^{32/33}P in Phosphatgruppen phosphorylierter Proteine. Kurze Einbauzeiten liefern eher eine Momentaufnahme, lange eher ein kumuliertes Bild. Der Nachweis erfolgt über Autoradiographie oder massenspektrometrische Verfahren. Auch chemisch modifizierte Aminosäuren für eine spätere bioorthogonale Fluoreszenzmarkierung sind möglich.

Vor der Trennung können bis zu drei Proteinextrakte mit unterschiedlichen kovalent bindenden Fluoreszenzfarbstoffen markiert, gemischt und gemeinsam getrennt werden. Bei der Difference Gel Electrophoresis (DIGE) werden etwa Cy2, Cy3 und Cy5 separat detektiert und verglichen. Nachteile sind die mögliche Massenbeeinflussung durch den Farbstoff sowie dessen Instabilität und Kosten. Nach der Trennung dienen unter anderem Coomassie-Brillant-Blau, Silberfärbung oder negative Zink-Färbung zur Mengenbestimmung; diese Verfahren sind nicht linear. Fluoreszenzfarbstoffe wie SYPRO Ruby und Flamingo liefern lineare Signale, Diamond ProQ markiert phosphorylierte und Emerald ProQ glykosylierte Proteine. In bakteriellen Extrakten lassen sich oft weit über tausend Proteinspezies nachweisen, in Mausembryonen circa 10.000 Spots.

Digitalisierte Gelbilder bestehen aus Pixeln mit Grauwerten; Auflösung bestimmt die Genauigkeit in x- und y-Richtung, Farbtiefe die Zahl verfügbarer Graustufen. Weißlichtscanner erfassen sichtbare Farbstoffe, Laserscanner Fluoreszenz und Phosphorimager radioaktive Signale. Für quantitative Analysen werden Hintergrund, Artefakte und Bildrauschen entfernt. Dann werden Spots lokalisiert, ihre Umrisse bestimmt, die kalibrierten Signalwerte innerhalb der Umrisse aufsummiert und die Rohquantitäten normiert.

Bei Multiplexing entstehen aus einem Gel mehrere getrennte Bilder, etwa für Proteinmenge und Phosphorylierung; sie können als Falschfarbenbild kombiniert werden. DIGE erlaubt ebenfalls die getrennte Darstellung von bis zu drei Proben auf demselben Gel. Laufunterschiede zwischen Gelen erschweren den Vergleich. Image Warping korrigiert seit 2000 Gelbilder anhand aller Pixelinformationen positionell, sodass entsprechende Spots an gleichen Positionen liegen. Ein Spotconsensus aus einem Kompositbild aller Gele eines Experiments kann Spotzuordnungsfehler ausschließen. Proteinidentitäten werden beispielsweise durch Edman-Abbau oder MALDI-TOF-Massenspektrometrie bestimmt; Proteomkarten verbinden solche Identifikationen mit positionell angeglichenen Kompositbildern.

Varianten, Vorteile und Grenzen

Klassische 2D-Gele trennen nach pI und Größe, doch auch andere Kombinationen sind möglich, etwa zwei Detergenzien, Blue-native-Elektrophorese gefolgt von SDS-Gelelektrophorese oder oxische und reduzierende Bedingungen. Die IEF erfolgt meist horizontal in Streifen oder vertikal in zylindrischen Gelen. Die zweite Trennung kann vertikal zwischen Glasplatten, horizontal auf Kühlplatten oder in radialsymmetrischen Gelscheiben erfolgen. In radialsymmetrischen Systemen können bis zu sechs Ansätze auf einer Gelscheibe getrennt werden. Geometrisch dreidimensionale Gele können simultan 36 IEF-Gele auf einem Gelblock trennen.

Vorteile sind die unmittelbar sichtbare qualitative Einschätzung des Proteinmusters, der Zugang zu verschiedenen Spezies desselben Primärproteins bei unterschiedlichen Massen und/oder pI, die Parallelisierung von je nach Gerät bis zu 12 Gelen sowie vergleichsweise überschaubare Investitionen. Getrennte Gele können gelagert und später weiterverarbeitet werden.

Grenzen der Methode sind die bevorzugte Trennung hydrophiler Proteine mit einem GRAVY Index kleiner und nahe 1, Überlappungen starker mit schwachen Spots und eine begrenzte Sensitivität sowie Gelkapazität. Daher werden vor allem abundante Proteine wie Zytoskelettproteine und metabolische Enzyme erfasst, gering exprimierte Proteine wie Transkriptionsfaktoren meist nicht. Zu hohe Gesamtproteinmengen können die Verhältnisse der Proteinspezies verzerren. Basische Proteine sind schwerer zu separieren; effizient ist das System hauptsächlich im pH-Bereich von 3 bis 10. Die Reproduzierbarkeit ist begrenzt und hängt unter anderem von Hersteller, Anwender, Gelbestandteilen und Elektrophoresepuffern ab.