Gelelektrophorese

Grundidee und Trennprinzip

Die Gelelektrophorese ist eine analytische Methode der Chemie und Molekularbiologie. Sie trennt Gemische unterschiedlicher geladener Moleküle. Die Trennung ist wichtig, um die einzelnen Bestandteile anschließend messen oder untersuchen zu können.

Eine Probe wandert in einem elektrischen Feld durch ein Gel, das in einer ionischen Pufferlösung, dem Elektrophoresepuffer, liegt. Das Gel wirkt als Molekularsieb: Größe und Ladung bestimmen, wie schnell sich Moleküle bewegen. Kleine negativ geladene Moleküle (Anionen) wandern am schnellsten zur positiv geladenen Anode. Positiv geladene Moleküle (Kationen) wandern zur negativ geladenen Kathode.

Die Ogston-Siebtheorie beschreibt, wie eine festgelegte Porosität der Gelmatrix sphärische Makromoleküle, etwa Proteine oder Micellen, zurückhält. Die Reptationstheorie erklärt die Retention von nicht sphärischen Makromolekülen wie DNA und RNA durch deren Reibung an der Gelmatrix.

Gelarten und ihre Eigenschaften

Die Polymermoleküle eines Gels bilden ein dreidimensionales, unterschiedlich engmaschiges Gitter. Dieses verlangsamt die Wanderung der Moleküle im elektrischen Feld.

Agarosegele sind relativ großporig: Bei einem einprozentigen Gel beträgt die Porengröße 150 nm, bei einem 0,16-prozentigen Gel 500 nm. Sie eignen sich besonders zur Trennung von Nukleinsäuren, außerdem von DNA und hochmolekularen Proteinen. Die Konzentration an Agarose beeinflusst den Abstand zwischen DNA-Banden unterschiedlicher Länge. Höhere Konzentrationen benötigen längere Laufzeiten, manchmal sogar Tage. Agarose wird aus natürlichen Polysaccharidpolymeren aus Seetang hergestellt; Ergebnisse können nach dem Experiment in einem Plastikbeutel tiefgekühlt gelagert werden.

Polyacrylamidgele entstehen durch Polymerisation von Acrylamid. Ihre Poren sind mit 3–6 nm wesentlich kleiner; die Größe hängt von Acrylamidkonzentration und Vernetzungsgrad ab. Häufig trennt man damit Proteine zwischen 5 und 200 kDa. Es gibt Trenn- und Sammelgele.

Auch teilweise hydrolysierte Kartoffelstärke in Konzentrationen von 5 % bis 10 % kann verwendet werden. Dieses untoxische Medium dient der Elektrophorese nicht-denaturierter Proteine. Die Trennung erfolgt nach Größe und Ladung; sichtbar gemacht wird sie mit Naphthol-Schwarz- oder Amido-Schwarz-Färbung. Ohne Biozide können Stärkegele mikrobiell zersetzt werden.

Ablauf der Trennung

Die klassische Gelelektrophorese wird als Zonenelektrophorese durchgeführt. Für eine höhere Auflösung kann die diskontinuierliche Elektrophorese eingesetzt werden.

Während der Elektrophorese entsteht Wärme. Sie muss abgeführt werden, damit optimale und reproduzierbare Bedingungen bestehen. Deshalb soll die Elektrophorese in gekühlten Apparaturen bei konstanten Temperaturen erfolgen.

Idealerweise wird der Lauf beendet, sobald die kleinsten beziehungsweise mobilsten Moleküle das Ende des Gels erreicht haben. Dann ist die Auftrennung der Moleküle möglichst groß.

Banden erkennen und auswerten

Gleiche Moleküle wandern im Gel in diskreten Zonen, die umgangssprachlich Banden heißen. Mehrere Proben können gleichzeitig nebeneinander auf demselben Gel laufen. Sind die Größen bestimmter Moleküle bekannt, lassen sich die Größen anderer Moleküle durch Vergleich der Banden abschätzen. Dafür dienen kommerziell erhältliche Molekülmassenstandards aus DNA oder Proteinen. Ein Komigrationsstandard vergleicht eine unbekannte mit einer bekannten Probenzusammensetzung.

Nach Färbung sowie Fotografie oder Scan kann eine densitometrische Auswertung die Menge einer Substanz oder den relativen Anteil einer Bande bestimmen. Bei sehr dunklen Banden kann der innere Bereich wegen fehlender Lichteinstrahlung nicht berücksichtigt werden. Laufweiten, Molekülmassen, Quantifizierungen und Normalisierung werden meist mit Auswertungssoftware bestimmt.

Moleküle werden entweder vor der Elektrophorese radioaktiv markiert und danach durch Autoradiographie nachgewiesen oder nach der Elektrophorese gefärbt. Ethidiumbromid interkaliert mit Nukleinsäuren und macht sie unter UV-Licht sichtbar. Proteine können beispielsweise mit Coomassie-Brillant-Blau oder durch Silberfärbung angefärbt werden. Beim anschließenden Blotting werden Proteine im Western Blot mit markierten Antikörpern nachgewiesen, DNA im Southern Blot durch Hybridisierung mit DNA- oder RNA-Sonden und mRNA im Northern Blot durch Hybridisierung mit Nukleotidsonden.

Anwendungen

Gelelektrophoresen werden in Molekularbiologie, Biochemie und Lebensmittelanalytik eingesetzt. Gele lassen sich selbst herstellen; fertige Gele und passende Puffersysteme sind auch kommerziell erhältlich.

Spezialanwendungen sind SDS-PAGE zur Trennung von Stoffgemischen, häufig Proteinen, nach Molekülgröße, IEF zur Trennung von Proteinen nach ihrem isoelektrischem Punkt und die 2D-Gelelektrophorese als Kombination aus SDS-Page und IEF für komplexe Proteingemische. Weitere Anwendungen sind die Nativ-Gelelektrophorese zur Untersuchung der Proteinfaltung, SDD-AGE zur Untersuchung von Proteinaggregaten, Pulsed-Field-Gelelektrophorese (PFGE) für große DNA-Fragmente sowie Kapillarelektrophorese (CE).