Elektrophorese

Grundprinzip und Trennung

Elektrophorese ist die Wanderung geladener kolloidaler Teilchen oder gelöster geladener Moleküle in einem elektrischen Feld. Meist handelt es sich um Zwitterionen, also Moleküle mit positiven und negativen Ladungsanteilen, deren Gesamt- oder Nettoladung positiv oder negativ sein kann. Sie wird oft durch das Zeta-Potential charakterisiert.

Die Methode trennt Stoffgemische, besonders Molekülgemische: Moleküle wandern je nach Ionenladung und Teilchenradius unterschiedlich schnell durch ein Trägermaterial und werden dadurch entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilität aufgetrennt. Als Trägermaterial dienen Flüssigkeiten, Gele – meist Polyacrylamid oder Agarose – oder Feststoffe.

Die Wanderung wird physikalisch durch Scherkräfte in der elektrischen Doppelschicht um ein Kolloid verursacht (Stern-Doppelschicht). Diese setzt die geladene Flüssigkeit relativ zum Makromolekül in Bewegung. Auch das Ionenmilieu der stromführenden Lösung beeinflusst den Vorgang wesentlich.

Einflussgrößen und Gele

Die Drift- oder Wanderungsgeschwindigkeit v ist proportional zur Feldstärke E und zur Ionenladung Q. Sie ist umgekehrt proportional zum Teilchenradius r und zur Viskosität η, also zur Zähflüssigkeit des Stoffes.

Bei der Gelelektrophorese wirkt das Gel zusätzlich als Molekularsieb. Sein Vernetzungsgrad bestimmt die Porenweite. Sind Teilchen im Verhältnis zu den Poren groß, werden sie stärker gebremst, als es allein durch die Viskosität zu erwarten wäre.

Agarose-Gele werden vor allem zur Auftrennung von DNA-Fragmenten verwendet, Polyacrylamid-Gele meist für Proteine. Bei Proteinen zählen SDS-PAGE und Western Blot zu den überwiegend eingesetzten Verfahren. Für eine Trennung nach Molekülmasse statt nach unterschiedlichen Ladungsdichten werden Proteine mit dem Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) beladen und durch Aufkochen denaturiert. In einprozentigen SDS-Lösungen binden circa 1,4 Gramm SDS pro Gramm Protein. Die negativ geladenen Sulfatgruppen fördern die Auffaltung und Linearisierung der Proteine; vorhandene Disulfidbrücken werden bei der Molmassenbestimmung durch Reduktionsmittel in Thiole überführt. Da mehrere hundert negativ geladene SDS-Moleküle pro Protein binden, ist die Eigenladung der Proteine im basischen pH des Gels vernachlässigbar.

Elektrophoretische Mobilität

Eine Trennung gelingt nur, wenn die elektrophoretische Mobilität der zu trennenden Teilchen verschieden ist. Sie fasst die physikalischen Einflüsse zusammen, welche die Wanderungsgeschwindigkeit bestimmen.

Die antreibende Kraft F auf ein Teilchen der Ladung q im Feld der Stärke E lautet: F = q · E

Als Gegenkraft wirkt bei idealisiert kugelförmigen Teilchen die Reibung nach dem Gesetz von Stokes: F = 6 · π · r · η · v

Daraus folgt für den idealisierten, trägerfreien Fall die theoretische elektrophoretische Mobilität bzw. Ionenbeweglichkeit: μₑ,ₚ⁰ = v/E = q/(6 · π · r · η)

Diese Beziehung setzt einen unendlich verdünnten, praktisch salzfreien Elektrolyten und konstante Geschwindigkeit voraus. Reale Elektrophoresen werden außerdem durch Reibung zwischen Hydrathüllen (elektrophoretischer Effekt), die Deformation der Ladungsverteilung im Feld (Relaxation), den Dissoziationsgrad des Elektrolyten sowie durch Molekularsieb-, Elektroosmose- und Adsorptionseffekte des Trägermaterials beeinflusst. Molekulardynamiksimulationen legen nahe, dass wegen der Wasserstruktur an Oberflächen auch ungeladene Teilchen elektrophoretische Aktivität zeigen können. Empirisch fand Offord: μ = Z/M^(2/3), wobei Z die Nettoladung und M die Molmasse ist.

Wärme als Begrenzung

Die maximal anlegbare Spannung ist durch die Erwärmung des Gels begrenzt. Wärme entsteht durch Reibungseffekte wandernder Moleküle. Sie kann zu ungleichmäßiger Wanderung und welligen Laufmittelfronten führen, die Diffusion verstärken und dadurch unschärfere Banden erzeugen sowie Moleküle denaturieren.

Die Wärmeentwicklung hängt von Spannung und elektrischer Leitfähigkeit des Systems, besonders des Elektrophoresepuffers, ab. Kühlung ermöglicht höhere Spannungen. Weil Wärme die Methode für präparative Zwecke begrenzt, wird Elektrophorese fast ausschließlich analytisch genutzt; eine Ausnahme ist die trägerfreie Elektrophorese.

Nach dem Joule-Lenz-Gesetz gilt Qw = Eel = P · t. Mit P = U · I und U = R · I ergibt sich: Qw = I² · R · t = (U²/R) · t. Die Wärmeentwicklung steigt somit mit dem Quadrat der Spannung.

Verfahren und Anwendungen

Zu den Formen der Elektrophorese gehören insbesondere Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, SDS-PAGE, Nativ-PAGE, 2D-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Kapillarelektrophorese, Serumelektrophorese, Pulsed-Field-Gelelektrophorese, Zonenelektrophorese, Affinitätselektrophorese, Immun- und Lipidelektrophorese, Isotachophorese sowie die trägerfreie Free-Flow- und Dichtegradientenelektrophorese.

Hauptsächlich ist Elektrophorese ein Analyseverfahren in Biologie und Medizin. Wichtige Anwendungen sind Serumelektrophorese, DNA-Analyse von Fragmenten und DNA-Sequenzierung. Dabei wird genutzt, dass Moleküle unterschiedlicher Länge getrennt werden können. Sie ist zudem Grundlage für Proteintrennungen und Verfahren der Proteomforschung.

Auswertesoftware bestimmt Gelmesswerte wie Laufweiten, Molmassen, Quantifizierungen oder Normalisierung. Die grafische Ergebnisdarstellung heißt Elektropherogramm. Präparative Verfahren, unter anderem die Free-Flow-Elektrophorese, können Milligramm-Mengen gereinigter Proteine gewinnen. Weitere technische Anwendungen sind elektronisches Papier, kathodische Tauchlackierung und Elektrofiltration.