Stern-Volmer-Gleichung

Grundidee und Formel

Die Stern-Volmer-Gleichung beschreibt in der Physikalischen Chemie, wie stark die Fluoreszenz eines fluoreszierenden Farbstoffes von der Konzentration eines löschenden Stoffes abhängt. Der fluoreszierende Farbstoff heißt Fluorophor, der löschende Stoff heißt Quencher. Ein Quencher verringert die Fluoreszenz, weil er verhindert, dass ein angeregtes Fluorophor Licht als Photon aussendet.

Die klassische Form der Gleichung lautet:

{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}=1+K_{SV}\cdot [\mathrm {Q} ]}

Dabei ist {\displaystyle F_{0}} die Fluoreszenzintensität des Fluorophors ohne Quencher, {\displaystyle F} die Fluoreszenzintensität desselben Fluorophors mit Quencher, {\displaystyle \mathrm {[Q]} } die Konzentration des Quenchers und {\displaystyle K_{SV}} die Stern-Volmer-Konstante. Häufig wird die Gleichung auch so geschrieben:

{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}-1=K_{SV}\cdot \mathrm {[Q]} }

Trägt man {\displaystyle (F_{0}/F)-1} gegen {\displaystyle \mathrm {[Q]} } auf, entsteht bei Gültigkeit der Gleichung ein linearer Zusammenhang. Die Steigung dieser Geraden ist {\displaystyle K_{SV}}. So kann die Stern-Volmer-Konstante experimentell aus Messwerten bestimmt werden.

Wichtige Voraussetzungen sind: Alle Moleküle des Fluorophors müssen für den Quencher gleich gut erreichbar sein, sodass für alle dieselbe Stern-Volmer-Konstante gilt. Außerdem darf der Quencher die Fluoreszenz nur auf eine Weise löschen. Wenn verschiedene Fluorophor-Gruppen unterschiedlich erreichbar sind oder mehrere Löschmechanismen gleichzeitig wirken, muss die Gleichung abgeändert werden.

Dynamische Fluoreszenzlöschung

Bei der dynamischen Fluoreszenzlöschung, auch dynamisches Quenching oder Stoßlöschung genannt, kollidiert der Quencher mit dem Fluorophor. Wenn sich das Fluorophor bei der Kollision im angeregten Zustand befindet, kehrt es ohne Aussenden eines Photons in den Grundzustand zurück. Die Energie wird also strahlungslos abgegeben.

Für dynamische Fluoreszenzlöschung gilt:

{\displaystyle K_{SV}=K_{d}=\tau {0},k{q}}

Dabei ist {\displaystyle k_{q}} die bimolekulare Quenchingkonstante und {\displaystyle \tau _{0}} die Lebensdauer des angeregten Zustandes des Fluorophors ohne Quencher. Die bimolekulare Quenchingkonstante kann mit den Lebensdauern berechnet werden:

{\displaystyle k_{q}={\frac {1}{\mathrm {[Q]} }}\cdot \left({\frac {1}{\tau }}-{\frac {1}{\tau _{0}}}\right)}

Außerdem kann {\displaystyle k_{q}} als {\displaystyle k_{q}=\gamma \cdot k_{0}} dargestellt werden. Dabei ist {\displaystyle k_{0}} der bimolekulare Ratenkoeffizient für Kollisionen; er beschreibt, mit welcher Wahrscheinlichkeit Fluorophor und Quencher zusammenstoßen. Er kann mit der Smoluchowski-Gleichung berechnet werden. {\displaystyle \gamma } ist die Quencheffizienz und gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit ein Stoß wirklich zur Löschung führt. Sie kann Werte zwischen null und eins annehmen: Bei {\displaystyle \gamma =0} löscht der Quencher nie, bei {\displaystyle \gamma =1} löscht er bei jedem Stoß.

Charakteristisch für dynamische Löschung ist, dass die Lebensdauer {\displaystyle \tau } des angeregten Zustandes in Anwesenheit des Quenchers abnimmt. Daher gilt:

{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}={\frac {\tau {0}}{\tau }}=1+K{d}\cdot \mathrm {[Q]} }

Bei gleicher Quencherkonzentration wird {\displaystyle K_{d}} bei steigender Temperatur prinzipiell größer, weil die Diffusionsgeschwindigkeit des Quenchers und damit die Zahl der Stöße zunimmt. Das unterscheidet dynamische von statischer Fluoreszenzlöschung.

Für eine heterogene Fluorophorpopulation, also mehrere unterscheidbare Fluorophorgruppen oder chemische Umgebungen, gilt:

{\displaystyle {\frac {F}{F_{0}}}=\sum {i=1}^{n}{\frac {f{i}}{1+K_{d,,i},\mathrm {[Q]} }}}

Dabei ist {\displaystyle K_{d,,i}} die Stern-Volmer-Konstante der iten Fluorophorpopulation und {\displaystyle f_{i}} ihr Anteil an der Gesamtintensität:

{\displaystyle f_{i}={\frac {F_{i}}{\sum {i=1}^{n}F{i}}}}

Herleitung der dynamischen Gleichung

Die Herleitung betrachtet die möglichen Wege eines Fluorophors. Durch Absorption eines Photons geht das Fluorophor {\displaystyle \mathrm {F} } in den angeregten Zustand {\displaystyle \mathrm {F^{*}} } über:

{\displaystyle \mathrm {F} +h\cdot \nu {\text{Absorption}}\ {\xrightarrow {k{a}}}\ \mathrm {F^{*}} }

Aus diesem Zustand kann es auf drei Wegen zurückkehren: durch Fluoreszenz mit Emission eines Photons, durch strahlungslose Wärmeabgabe oder durch Quenching. Die Wege werden mit den Geschwindigkeitskonstanten {\displaystyle k_{f}}, {\displaystyle k_{w}} und {\displaystyle k_{q}} beschrieben:

{\displaystyle \mathrm {(A)} \quad \mathrm {F^{*}} \ {\xrightarrow {k_{f}}}\ \mathrm {F} +h\cdot \nu _{\text{Emission}}}

{\displaystyle \mathrm {(B)} \quad \mathrm {F^{*}} \ {\xrightarrow {k_{w}}}\ \mathrm {F} +{\text{Wärme}}}

{\displaystyle \mathrm {(C)} \quad \mathrm {F^{*}+Q} \ {\xrightarrow {k_{q}}}\ \mathrm {F+Q^{'}} }

Die Fluoreszenz-Quantenausbeute ist definiert als:

{\displaystyle \phi ={\frac {I_{e}}{I_{a}}}}

{\displaystyle I_{e}} ist die Anzahl der durch Fluoreszenz emittierten Photonen pro Zeitspanne, {\displaystyle I_{a}} die Anzahl der absorbierten Photonen pro Zeitspanne. Daraus ergibt sich:

{\displaystyle \phi ={\frac {k_{f}}{k_{f}+k_{w}+k_{q}\cdot \mathrm {[Q]} }}}

Ohne Quencher, also bei {\displaystyle \mathrm {[Q]} =0}, gilt:

{\displaystyle \phi {0}={\frac {k{f}}{k_{f}+k_{w}}}}

Für das Verhältnis folgt:

{\displaystyle {\frac {\phi {0}}{\phi }}=1+{\frac {k{q}\cdot \mathrm {[Q]} }{k_{f}+k_{w}}}}

Die Lebensdauer des angeregten Zustandes ist:

{\displaystyle \tau ={\frac {1}{k_{f}+k_{w}+k_{q}\cdot \mathrm {[Q]} }}}

Ohne Quencher ist sie:

{\displaystyle \tau {0}={\frac {1}{k{f}+k_{w}}}}

Damit ergibt sich:

{\displaystyle {\frac {\phi _{0}}{\phi }}=1+\tau {0},k{q}\cdot \mathrm {[Q]} }

und außerdem:

{\displaystyle {\frac {\phi _{0}}{\phi }}={\frac {\tau _{0}}{\tau }}}

Da die Quantenausbeute {\displaystyle \phi } direkt proportional zur Fluoreszenzintensität {\displaystyle F} ist, folgt:

{\displaystyle {\frac {\phi {0}}{\phi }}={\frac {F{0}}{F}}=1+\tau {0},k{q}\cdot \mathrm {[Q]} }

und:

{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}={\frac {\tau _{0}}{\tau }}}

Statische Fluoreszenzlöschung

Bei der statischen Fluoreszenzlöschung, auch statisches Quenching genannt, bildet das Fluorophor {\displaystyle \mathrm {F} } mit dem Quencher {\displaystyle \mathrm {Q} } einen nicht fluoreszierenden Komplex {\displaystyle \mathrm {FQ} }:

{\displaystyle \mathrm {F;+;Q\ \leftrightharpoons \ FQ} }

Das chemische Gleichgewicht {\displaystyle K_{s}} wird nach dem Massenwirkungsgesetz beschrieben und ist gleich der Stern-Volmer-Konstante:

{\displaystyle K_{SV}=K_{s}=\mathrm {\frac {[FQ]}{[F][Q]}} }

Dabei ist {\displaystyle \mathrm {[FQ]} } die Konzentration des Komplexes, {\displaystyle \mathrm {[F]} } die Konzentration des ungebundenen Fluorophors und {\displaystyle \mathrm {[Q]} } die Konzentration des ungebundenen Quenchers.

Im Gegensatz zur dynamischen Löschung bleibt bei statischer Löschung die Lebensdauer des angeregten Zustandes unverändert:

{\displaystyle {\frac {\tau _{0}}{\tau }}=1}

Der Grund ist, dass bei statischer Löschung nur die Anzahl der anregbaren Fluorophore reduziert wird. Diejenigen Fluorophore, die noch fluoreszieren können, behalten ihre Lebensdauer. Auch die Temperaturabhängigkeit unterscheidet sich: Bei gleicher Quencherkonzentration nimmt {\displaystyle K_{s}} bei steigender Temperatur prinzipiell ab, weil der Quencher bei höherer Temperatur schlechter am Fluorophor gebunden wird.

Die Herleitung nutzt die Gesamtkonzentration des Fluorophors:

{\displaystyle \mathrm {[F]_{0}=[F]+[FQ]} ,}

Zusammen mit der Assoziationskonstante ergibt sich:

{\displaystyle \mathrm {\frac {[F]{0}}{[F]}} =1+K{s}\cdot \mathrm {[Q]} }

Da die Fluoreszenzintensität {\displaystyle F} direkt proportional zur Konzentration {\displaystyle \mathrm {[F]} } des Fluorophors ist, folgt:

{\displaystyle \mathrm {\frac {[F]{0}}{[F]}} ={\frac {F{0}}{F}}=1+K_{s}\cdot \mathrm {[Q]} }

Kombinierte Löschung

Wenn dynamische und statische Fluoreszenzlöschung gleichzeitig auftreten, ist die einfache Stern-Volmer-Gleichung nicht anwendbar. Dann gilt die Gleichung für kombinierte Löschung:

{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}=(1+K_{d}\cdot \mathrm {[Q]} )(1+K_{s}\cdot \mathrm {[Q]} )}

{\displaystyle K_{d}} ist die Stern-Volmer-Konstante der dynamischen Löschung, {\displaystyle K_{s}} die Stern-Volmer-Konstante der statischen Löschung. Der Stern-Volmer-Plot ist in diesem Fall nicht mehr linear. Ein nichtlineares Verhalten weist deshalb auf kombinierte Löschung hin.

Wegen des Zusammenhangs zwischen dynamischer Löschung und Fluoreszenzlebensdauer kann man auch schreiben:

{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}={\frac {\tau {0}}{\tau }}\cdot (1+K{s}\cdot \mathrm {[Q]} )}

Für die Lebensdauerverhältnisse gilt bei kombinierter Löschung:

{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}>{\frac {\tau _{0}}{\tau }}>1}

Auch dieses Verhalten ist ein Hinweis auf kombinierte Fluoreszenzlöschung. Ist {\displaystyle (\tau {0}/\tau )} bekannt, kann {\displaystyle K{s}} bestimmt werden. Eine linearisierte Form lautet:

{\displaystyle \left({\frac {F_{0}}{F}}-1\right)\cdot {\frac {1}{\mathrm {[Q]} }}=\left(K_{d}+K_{s}\right)+K_{d}\cdot K_{s}\cdot \mathrm {[Q]} }

Trägt man den linken Term gegen {\displaystyle \mathrm {[Q]} } auf, erhält man wieder einen linearen Zusammenhang. Aus der Steigung {\displaystyle (K_{d}\cdot K_{s})} und dem Achsenabschnitt {\displaystyle (K_{d}+K_{s})} können {\displaystyle K_{d}} und {\displaystyle K_{s}} ermittelt werden.

Anwendungen in Proteinen

Die Stern-Volmer-Gleichung kann genutzt werden, um Informationen über die Lage von Fluorophoren in Makromolekülen zu gewinnen. Ein wichtiges Beispiel sind Proteine. Dort kann die Aminosäure Tryptophan als Fluorophor dienen. Verschiedene Quencher erreichen Tryptophanreste unterschiedlich gut, abhängig unter anderem von ihrer Ladung und Größe.

Ein Tryptophanrest ist für den geladenen Quencher Iodid {\displaystyle I^{-}} nur erreichbar, wenn er an der Oberfläche des Proteins in das wässrige Medium reicht. In hydrophobe Bereiche dringt Iodid nur schlecht ein. Für Acrylamid ist ein Tryptophanrest nur erreichbar, wenn er an der Oberfläche liegt und sich nicht in einer zu kleinen Tasche befindet, weil Acrylamid wegen seiner Größe nicht in jede Stelle des Proteins vordringen kann. Der Quencher {\displaystyle O_{2}} (bimolekularer Sauerstoff) kann dagegen auch tief im Protein verborgene Tryptophane löschen, weil er klein genug und ungeladen ist.

Durch den Vergleich von Stern-Volmer-Plots für verschiedene Quencher lässt sich daher die relative Lage von Fluorophoren wie Tryptophan in Proteinen untersuchen. Außerdem kann man ein Protein im gefalteten und im ungefalteten Zustand vergleichen. Bei der Entfaltung werden zuvor unzugängliche Fluorophore für den verwendeten Quencher zugänglich.