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Enzymkinetik
Die Enzymkinetik ist ein Teilgebiet der biophysikalischen Chemie. Sie beschreibt, wie schnell enzymkatalysierte chemische Reaktionen verlaufen.
Inhalt5 Abschnitte
Grundlagen und Michaelis-Menten-Modell
Die Enzymkinetik ist ein Teilgebiet der biophysikalischen Chemie. Sie untersucht, wie schnell enzymkatalysierte Reaktionen ablaufen und wie die Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration abhängt. Sie ist für Biologie und Medizin wichtig, weil sie Enzymaktivität, katalytische Effizienz und damit Enzymfunktionen beschreibbar macht.
Für ein Enzym mit einer Substratbindungsstelle wird die Reaktion in Bindung und Umsetzung zerlegt: E + S ⇌ ES → E + P. E ist das freie Enzym, S das Substrat, ES der Enzym-Substrat-Komplex und P das Produkt. k₁, k₋₁ und kcat sind Geschwindigkeitskonstanten.
Für die reine Bindung gilt die Dissoziationskonstante Kd = [E][S]/[ES] = k₋₁/k₁. Sie hat die Dimension einer Konzentration. Bei [S] = Kd sind jeweils die Hälfte der Enzymmoleküle frei und substratgebunden: Das Enzym ist halb gesättigt. Je kleiner Kd ist, desto höher ist die Affinität, also die Bindungsstärke des Enzyms für das Substrat.
Für die gesamte Reaktion lautet die Michaelis-Menten-Konstante Km = [E][S]/[ES] = (k₋₁ + kcat)/k₁. Unter den Annahmen [E]t = [E] + [ES], v = kcat·[ES] und vmax = kcat·[E]t ergibt sich die Michaelis-Menten-Gleichung: v = vmax·[S]/(Km + [S]). Bei [S] = Km gilt v = vmax/2. Der Graph steigt hyperbelförmig und nähert sich bei hoher Substratkonzentration der maximalen Geschwindigkeit vmax an. Die Anfangssteigung ist vmax/Km; daraus folgt die katalytische Effizienz kcat/Km.
Zur zuverlässigen Bestimmung von Km und vmax aus Messwerten werden nichtlineare Regressionsverfahren, etwa Simplex- oder Levenberg-Marquardt-Verfahren, empfohlen. Linearisierungen sind für die Präsentation nützlich, aber für die Parameterschätzung ungenauer.
Mehrere Bindungsstellen und Kooperativität
Bei Enzymen mit n Bindungsstellen wird die Bindung modelliert als E + nS ⇌ ESn. Die scheinbare Dissoziationskonstante lautet KD = [E][S]ⁿ/[ESn]. Die Halbsättigungskonstante KA = KD^(1/n), auch K50, hat die Dimension einer Konzentration. Bei [S] = KA ist die Hälfte der Enzyme substratgebunden; eine kleinere KA bedeutet höhere Affinität.
Der Anteil gebundenen Enzyms ist die Hill-Gleichung θ = [S]ⁿ/(KD + [S]ⁿ) = 1/(1 + (KA/[S])ⁿ). Ist die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zu θ, folgt v = vmax·[S]ⁿ/(KD + [S]ⁿ) beziehungsweise v = vmax/(1 + (KA/[S])ⁿ). Die Sättigungsfunktion r, das Verhältnis von gebundenem Substrat zu gesamtem Enzym, ist r = n·θ.
Der theoretische Hill-Koeffizient n entspricht der Anzahl der Bindungsstellen. In Messungen wird jedoch der empirische Hill-Koeffizient nH verwendet: Er ist der Wert, mit dem die Hill-Gleichung die gemessene Kinetik am besten beschreibt. nH ist meist kleiner als n und muss nicht ganzzahlig sein. Für nH = 1 entspricht die Hill-Gleichung der Michaelis-Menten-Gleichung mit KD = KA = Km.
nH > 1 beschreibt bei [S] > KA positive Kooperativität: Bindungsstellen beziehungsweise Untereinheiten wirken so zusammen, dass das Enzym schneller reagiert als nach Michaelis-Menten zu erwarten wäre. Je größer nH ist, desto stärker ist dieser Effekt; n ist die logische Obergrenze. nH < 1 beschreibt negative Kooperativität und eine langsamere Reaktion. Ohne beobachtbares Zusammenwirken heißt ein Enzym nicht kooperativ. Als Beispiel wird Hämoglobin genannt: Es besitzt n = 4 sauerstoffbindende Untereinheiten und hat einen bestimmten Hill-Koeffizienten nH von 2,8.
Aus den Konzentrationen EC10 und EC90, bei denen 10 % beziehungsweise 90 % von vmax erreicht werden, kann nH berechnet werden: nH = log(81)/log(EC90/EC10). Allgemein können dazu zwei verschiedene Konzentrationen ECP und ECQ bei 0 % < P % < 100 % und 0 % < Q % < 100 % verwendet werden.
Kurvenformen und direkte Darstellung
Im direkten v-[S]-Diagramm werden die gemessenen Anfangsgeschwindigkeiten gegen die vorgegebenen Substratkonzentrationen aufgetragen. Bei Michaelis-Menten-Kinetik lassen sich vmax aus der Sättigung und Km bei vmax/2 ablesen. Die Tangente im Ursprung hat die Steigung vmax/Km. Die direkt-lineare Auftragung wird auch Cornish-Bowden-Diagramm genannt; Messstreuung und Ausreißer lassen sich darin vergleichsweise gut erkennen.
Für die Hill-Kinetik steigt v = vmax·[S]^nH/(KD + [S]^nH) stets monoton und nähert sich vmax. Bei nH = 1 ist der Verlauf hyperbelförmig. Bei nH > 1 ist er S-förmig (sigmoidal) und besitzt einen Wendepunkt bei [S]w = (KD·(nH − 1)/(nH + 1))^(1/nH) = KA·((nH − 1)/(nH + 1))^(1/nH). Bei nH < 1 gibt es keinen Wendepunkt; der Verlauf heißt pseudohyperbol und ist durch bloßes Betrachten nicht sicher vom Fall nH = 1 zu unterscheiden.
Eine halblogarithmische Darstellung verwendet θ auf der y-Achse und das logarithmisch geteilte Verhältnis [S]/KA auf der x-Achse. Die Kurven sind logistische Funktionen mit den Asymptoten θ = 0 und θ = 1. Bei [S] = KA liegt Halbsättigung vor. Die Steigung dort beträgt nH·ln(10)/4 ≈ 0,5756·nH: Ein größerer Hill-Koeffizient bedeutet somit eine steilere Kurve.
Linearisierungen und ihre Aussage
Linearisierungsverfahren wurden früher häufig zur schnellen graphischen Bestimmung von Km und vmax verwendet. Messfehler können die Ergebnisse jedoch erheblich verfälschen; nichtlineare Regression liefert genauere Parameter. Alle genannten Darstellungen können auch Bindungsvorgänge von Carriern oder Rezeptoren beschreiben.
Im Lineweaver-Burk-Diagramm wird 1/v gegen 1/[S] aufgetragen: 1/v = (Km/vmax)·1/[S] + 1/vmax. Die Steigung ist Km/vmax, der y-Achsenabschnitt 1/vmax und der x-Achsenabschnitt −1/Km. Besonders kleine [S]-Werte werden durch die Kehrwertbildung stark fehleranfällig, weshalb die Methode zur Auswertung unverlässlich ist.
Im Eadie-Hofstee-Diagramm gilt v = −Km·v/[S] + vmax. Der y-Achsenabschnitt ist vmax, die negative Steigung ist −Km. Im Scatchard-Diagramm wird v/[S] gegen v aufgetragen: v/[S] = −(1/Km)·v + vmax/Km. Der x-Achsenabschnitt ist vmax, die Steigung −1/Km und der y-Achsenabschnitt vmax/Km. Scatchard- und Eadie-Hofstee-Diagramme dienen besonders zur Diagnose kooperativer Phänomene.
Im Hanes-Woolf-Diagramm gilt [S]/v = (1/vmax)·[S] + Km/vmax. Die Steigung ist 1/vmax, der y-Achsenabschnitt Km/vmax und der x-Achsenabschnitt −Km. Es wird als beste lineare Auftragungsmöglichkeit bezeichnet, dennoch ist auch hier eine lineare Regression wegen der Vermischung abhängiger und unabhängiger Variablen nicht sinnvoll.
Das Hill-Diagramm trägt log(θ/(1 − θ)) gegen log[S] auf: log(θ/(1 − θ)) = nH·log[S] − log KD. Ist vmax bekannt, kann θ durch v/vmax ersetzt werden. Bei passender Hill-Kinetik ergibt sich eine Gerade: Ihre Steigung ist nH, ihr x-Achsenabschnitt log KA. Liegen Messpunkte nicht auf einer Geraden, können zufällige oder systematische Fehler vorliegen; außerdem kann nH von der Konzentration abhängen.
Enzymhemmung
Viele Therapeutika und Gifte hemmen Enzyme. Die klassischen Analysen beziehen sich auf reversibel bindende Hemmstoffe; eine irreversible Bindung inaktiviert ein Enzym und gilt nicht als Hemmung. Die allgemeine Inhibitionsgleichung lautet: v = Vmax·[S]/(Km(1 + [I]/Ki) + [S](1 + [I]/Kii)). Ki ist die Dissoziationskonstante des Komplexes EI, Kii die des Komplexes EIS.
Bei kompetitiver Hemmung schließen sich Substrat und Inhibitor bei der Enzymbindung aus. Sie müssen nicht dieselbe Bindungsstelle besetzen; auch Konformationsänderungen können die jeweils andere Bindung verhindern. Hohe Substratkonzentrationen können den Inhibitor verdrängen. Deshalb bleibt Vmax gleich, während die scheinbare Km mit steigender [I] zunimmt. Im Lineweaver-Burk-Diagramm schneiden sich die Geraden bei 1/Vmax auf der y-Achse.
Bei unkompetitiver Hemmung bindet der Inhibitor nur an ES. Mehr Substrat verdrängt ihn nicht, sondern fördert seine Bindung. Die scheinbare Km sinkt, die scheinbare Affinität steigt und Vmax nimmt ab. Im Lineweaver-Burk-Diagramm entstehen parallele Geraden.
Bei nicht-kompetitiver Hemmung kann der Inhibitor an freies E und an ES binden. Für Ki = Kii verändert sich Km nicht. Bei Ki < Kii steigt die scheinbare Km mit [I]; bei Ki > Kii sinkt sie. Die Lineweaver-Burk-Geraden schneiden sich links von der y-Achse; bei Ki = Kii liegt der Schnittpunkt auf der x-Achse.
Die gemischt-kompetitive Hemmung ähnelt der nicht-kompetitiven Hemmung, aber der EIS-Komplex besitzt noch katalytische Aktivität. Das Lineweaver-Burk-Diagramm kann gleich aussehen. Im Sekundärdiagramm ergeben sich bei nicht-kompetitiver Hemmung Geraden, bei gemischt-kompetitiver Hemmung dagegen Kurven.
