Chromatographie

Grundprinzip und Bedeutung

Chromatographie ist ein chemisches Verfahren, mit dem ein Stoffgemisch in seine Einzelbestandteile aufgetrennt wird. Grundlage ist ihre unterschiedliche Verteilung zwischen zwei Phasen: Die stationäre Phase bewegt sich nicht, während die mobile Phase durch das Trennsystem strömt. Das Verfahren dient in der präparativen Chromatographie der Reinigung und Gewinnung von Substanzen. In der chemischen Analytik ermöglicht es, Bestandteile zu identifizieren oder ihre Mengen zu bestimmen. Es wird unter anderem in organischer und anorganischer Chemie, Pharmazie, Biochemie, Biotechnologie, Mikrobiologie, Lebensmittel- und Umweltchemie eingesetzt.

Die Moleküle einer Probe wechseln durch Wärmebewegung und Diffusion sehr häufig zwischen den beiden Phasen. In der mobilen Phase werden sie mit deren Geschwindigkeit transportiert; an der stationären Phase stehen sie vorübergehend still. Es handelt sich somit um einen schnellen „Stop-and-go“-Prozess und nicht um eine Verzögerung durch Reibung. Verschiedene Molekülarten verbringen im Mittel unterschiedlich große Zeitanteile in der mobilen Phase. Dadurch entstehen unterschiedliche mittlere Geschwindigkeiten und schließlich getrennte Stoffzonen oder Peaks.

Befinden sich beispielsweise im Mittel 45 % der A-Moleküle in der mobilen Phase, verbringen einzelne A-Moleküle aufgrund des dynamischen Gleichgewichts durchschnittlich 45 % ihrer Zeit dort. Ihre mittlere Geschwindigkeit beträgt deshalb 45 % der Geschwindigkeit der mobilen Phase. Für eine gute Trennung muss der Stoffaustausch zwischen beiden Phasen rasch erfolgen. Die Wege zwischen ihnen sollen kurz sein; pulverförmige stationäre Phasen besitzen daher möglichst kleine, einheitlich geformte Körner mit enger Korngrößenverteilung, beispielsweise von nur wenigen Mikrometern.

Ablauf, Phasen und zentrale Begriffe

Eine chromatographische Untersuchung umfasst die Erzeugung des Flusses der mobilen Phase, die Injektion der Probe, die Trennung und die Detektion. Der Fluss entsteht durch eine hydraulische Pumpe, Gasdruck, Kapillarkraft oder eine elektrische Spannung. Die Probe kann vor Beginn des Flusses eingebracht werden, etwa bei der Dünnschichtchromatographie, oder während die mobile Phase bereits strömt. Bei vielen Proben übernehmen Autosampler die automatische Injektion und Datenerfassung.

Die Detektion zeigt, wann eine Substanz einen bestimmten Punkt passiert oder wo sie nach der Trennung liegt. Dazu nutzt man physikalische Eigenschaften wie Lichtabsorption, Fluoreszenz, Lichtstreuung oder Wärmeleitfähigkeit. Alternativ erzeugen chemische Reaktionen ein Signal, beispielsweise die Färbung von Aminosäuren mit Ninhydrin, die seit 1948 verwendet wird. Reaktionen können bei der Säulenchromatographie auch vor der Trennung als Vorsäulenderivatisierung oder danach als Nachsäulenderivatisierung stattfinden. Bei präparativen Verfahren fängt ein Fraktionensammler die getrennten Substanzen auf.

Die stationäre Phase wechselwirkt mit den Analyten, also den untersuchten Stoffen, und bewegt sich nicht. In der Gaschromatographie kann sie eine Flüssigkeit oder ein Gel auf der Innenseite einer Kapillare sein. In der Flüssigchromatographie ist sie meist fest; möglich sind auch eine nicht mit der mobilen Phase mischbare Flüssigkeit auf einem Träger oder chemisch an den Träger gebundene Moleküle. Die mobile Phase transportiert die Probe. Sie ist bei der Flüssigchromatographie flüssig; bei der Gaschromatographie dienen Wasserstoff, Helium oder Stickstoff als Trägergase. In der Dünnschichtchromatographie heißt sie Fließmittel.

Elution bezeichnet das Herauslösen oder Verdrängen adsorbierter Stoffe durch die kontinuierliche Zugabe eines Lösungsmittels. Dieses Elutionsmittel ist die mobile Phase; die aus der Säule austretende Lösung heißt Eluat. Lösungsmittel lassen sich nach ihrer Elutionskraft an einer Referenzsubstanz, gewöhnlich Kieselgel oder Aluminiumoxid, in einer eluotropen Reihe ordnen.

Chromatographische Aufreinigungen sind bauartbedingt Batch-Verfahren: Es kann jeweils nur eine begrenzte Stoffmenge aufgetragen und getrennt werden. Für einen kontinuierlicheren Betrieb wurden die annulare Chromatographie sowie TMB- und SMB-Chromatographie entwickelt.

Retention, Zeiten und Säulen

Retention ist der durch Wechselwirkungen mit der stationären Phase verzögerte Durchfluss einer Substanz. Sie hängt wesentlich von drei Punkten ab: der Stärke ihrer Wechselwirkung mit der stationären Phase, ihrem Siedepunkt als Einfluss auf die Neigung zum Aufenthalt in der mobilen Phase und ihren Diffusionseigenschaften. Unpolare Substanzen zeigen Dispersionswechselwirkungen beziehungsweise Van-der-Waals-Bindungen. Polare Phasen können zusätzlich etwa Wasserstoffbrücken- oder Donator-Akzeptor-Bindungen eingehen. Spezielle Cyclodextrin-Derivate können sogar Enantiomere trennen, die gleiche Siedepunkte besitzen, aber unterschiedlich stark mit der stationären Phase wechselwirken.

Die Retentionszeit t_R ist die Gesamtzeit von der Injektion bis zur Detektion eines Analyten. Die Totzeit oder Durchflusszeit t_0 ist die Zeit, welche die mobile Phase oder eine nicht zurückgehaltene Substanz für den Weg durch die Apparatur benötigt. Sie lässt sich durch Injektion einer nahezu nicht wechselwirkenden Inertsubstanz bestimmen; ihr Detektorpeak erscheint nach t_0. Die Nettoretentionszeit oder reduzierte Retentionszeit t_N beschreibt den Aufenthalt in der stationären Phase:

t_N = t_R − t_0.

Aus der Durchflusszeit folgt das Durchflussvolumen:

Durchflussvolumen = Fluss der mobilen Phase · Durchflusszeit.

Diese Größe ist besonders für Berechnungen und den Methodentransfer zwischen HPLC-Säulen unterschiedlichen Volumens wichtig.

Eine Trennsäule ist eine hohle Röhre mit einem Durchmesser von wenigen Mikrometern bis zu mehreren Metern und einer Länge von wenigen Zentimetern bis zu 150 Metern. Bei einer Kapillarsäule ist nur die Innenwand beschichtet; eine gepackte Säule ist mit stationärer Phase gefüllt. Sie kann auch schlauchförmig aufgerollt sein.

Beim Säulenbluten verliert eine Säule geringe Anteile ihrer Matrix. In kleinem Umfang tritt dies im normalen Betrieb auf und trägt zur Alterung bei. Verstärkt wird es in der Gaschromatographie durch übermäßige Wärmebelastung und in der HPLC beispielsweise durch zu stark saure oder alkalische Elutionsmittel. Starkes Bluten verursacht hohes Signalrauschen und einen hohen Hintergrundwert, auch bei nachgeschalteten Verfahren wie der Massenspektrometrie.

Trennprinzipien und Umkehrphase

Alle chromatographischen Methoden beruhen auf der wiederholten Einstellung eines Gleichgewichts zwischen mobiler und stationärer Phase. Je nach physikalisch-chemischem Effekt unterscheidet man mehrere Trennprinzipien:

• Bei der Adsorptionschromatographie haften Stoffe unterschiedlich stark an der Oberfläche der stationären Phase. In der Flüssigchromatographie konkurrieren Proben- und Lösungsmittelmoleküle um deren Haftstellen.

• Die Verteilungschromatographie nutzt unterschiedliche Löslichkeiten. Ein Lösungsmittel bleibt als stationäre Phase auf einem Trägermaterial, während eine Flüssigkeit oder ein Trägergas die mobile Phase bildet.

• Bei der Ionenaustauschchromatographie bildet ein fester Ionenaustauscher unterschiedlich stabile Bindungen mit den Ionen der mobilen Lösung. Die Chelatbildner-Chromatographie bindet als besondere Form polyvalente Kationen selektiv über komplexbildende Gruppen und besitzt eine hohe Selektivität für Schwermetall-Ionen gegenüber Alkali- und Erdalkali-Ionen.

• Molekularsieb-, Gel-Permeations- beziehungsweise Gelfiltrations- und Ausschlusschromatographie trennen nach der Größe. Kleine Moleküle gelangen in Hohlräume der stationären Phase und werden verzögert. Große Moleküle sind davon ausgeschlossen und wandern schneller im bewegten Flüssigkeitsstrom.

• Die Affinitätschromatographie verwendet eine analytspezifische Verbindung als stationäre Phase und trennt hochselektiv durch nichtkovalente Kräfte. Bei der IMAC, der Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, sind Metallionen wie Fe, Co oder Ga über Komplexbindungen an eine Matrix gebunden. Fe und Ga dienen besonders der Aufreinigung phosphorylierter Proteine, Ni und Co der Anreicherung poly-Histidin-markierter Proteine.

• Die Thiol-Disulfid-Austausch-Chromatographie bindet vor allem außen liegende Thiolgruppen von Proteinen reversibel als kovalente Disulfide an fest gebundene Thiolgruppen.

• Bei der chiralen Chromatographie enthält die stationäre Phase ein Enantiomer. Mit den beiden Enantiomeren eines Racemats entstehen verschieden starke diastereomere Wechselwirkungen und damit unterschiedliche Verzögerungen.

Die Adsorptionschromatographie kann als normale Phase oder Umkehrphase betrieben werden. Die normale Phase kombiniert eine polare stationäre Phase, etwa Kieselgel oder Aluminiumoxid, mit einer unpolaren bis mittelpolaren mobilen Phase. Lipophile Stoffe werden leicht, polare schwer eluiert. Bei der Reversed Phase oder Umkehrphase ist die stationäre Phase unpolar, beispielsweise modifiziertes Kieselgel, und die mobile Phase polar, etwa gepuffertes Wasser; polare Stoffe werden leicht eluiert. In der HPLC verändert eine Gradienteneluierung die Lösungsmittelzusammensetzung langsam, beispielsweise von 80 % auf 20 % Wasseranteil. Dabei treten Aminosäuren früh und Alkane spät aus der Säule aus.

Verfahrensgruppen

Nach der mobilen Phase und der Anordnung der stationären Phase werden mehrere Hauptgruppen unterschieden. Zur Flüssigchromatographie gehören planare und säulengebundene Verfahren. Bei der Papierchromatographie dient Papier als feste Phase; bei der Dünnschichtchromatographie liegt eine feine Schicht, etwa aus Silikapartikeln, auf Aluminium, Kunststoff oder Glas. In beiden Fällen bewegt die Kapillarkraft die mobile Phase. Eine Variante ist die zirkuläre Dünnschichtchromatographie mit rotierender beschichteter Scheibe.

Die Niederdruckchromatographie verwendet Säulen von einem bis mehreren Zentimetern Durchmesser und dient vor allem präparativen Trennungen. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, HPLC, ist in der Analytik besonders verbreitet. Drücke bis über 1000 bar erzeugen in sehr fein gepackten Säulen Flussraten bis zu 5 ml/min. Ein langsamerer Durchfluss würde durch Längsdiffusion die Trennleistung verschlechtern. Bei der Elektrochromatographie bewegt eine Spannung die mobile Phase; sie befindet sich noch im Entwicklungsstadium und ist nicht mit Elektrophorese gleichzusetzen. Die Membranchromatographie verwendet statt einer gefüllten Säule eine ein- oder mehrlagige Membran. Bei Drücken bis 6 bar sind etwa 20-fach höhere Flussraten als in der Säulenchromatographie möglich.

In der Gaschromatographie gibt es gepackte Säulen und Kapillarsäulen. Gepackte Säulen enthalten feinkörniges Material, häufig überzogen mit einem dünnen Film einer weitgehend inerten, hochsiedenden Flüssigkeit. Bei Kapillarsäulen trägt nur die Innenwand eine dünne stationäre Schicht. Die stationäre Phase kann flüssig oder fest sein.

Die überkritische Fluidchromatographie, SFC, nutzt eine Substanz in einem Zustand zwischen Gas und Flüssigkeit als mobile Phase, meist Kohlendioxid. Als Träger der stationären Phase kommen dabei nur Säulen zum Einsatz. Zu den genannten Einzelverfahren zählen außerdem Gel-Permeations-, Anionenaustausch- und multidimensionale Chromatographie.

Kenngrößen und Trennleistung

Wichtige Größen sind Säulenlänge L, Totzeit t_0 und Retentionszeit t_R. Die lineare Durchflussgeschwindigkeit u der mobilen Phase ist

u = L/t_0.

Der Retentionsfaktor k gibt die zusätzliche Verzögerung gegenüber der Totzeit an:

k = (t_R − t_0)/t_0.

Für zwei Stoffe beschreibt der Selektivitätskoeffizient α die Güte ihrer unterschiedlichen Retention:

α = k_2/k_1.

Die chromatographische Auflösung R berücksichtigt Abstand und Breite zweier Peaks:

R = 2 · (t_R2 − t_R1)/(b_B2 + b_B1)

oder

R = 1,18 · (t_R2 − t_R1)/(FWHM_1 + FWHM_2).

Dabei ist b_B die Basislinienbreite und FWHM die Halbwertsbreite („Full Width at Half Maximum“). Der Faktor 1,18 folgt aus dem Verhältnis von Halbwerts- zu Basisbreite einer Gaußschen Glockenkurve.

Die Trennstufenzahl oder Bodenzahl N beschreibt, wie oft sich das Gleichgewicht zwischen stationärer und mobiler Phase in einer Säule einstellt. Ein größeres N bedeutet eine bessere Trennleistung. Es gilt:

N = 16 · (t_R/b_B)^2

oder

N = 5,55 · (t_R/FWHM)^2.

Die Peakkapazität n gibt an, wie viele Peaks zwischen t_0 und dem k-Wert eines bestimmten Peaks theoretisch bei R = 1,5, also mit Basislinientrennung, getrennt werden können:

n = 1 + (√N/4) · ln(1 + k_max).

Die Trennstufenhöhe H oder theoretische Bodenhöhe ist H = L/N. Praktische Werte liegen zwischen 0,1 und 0,5 mm. Je kleiner H, desto mehr Gleichgewichtseinstellungen passen auf die Säule und desto besser trennt sie. Förderlich sind kleine Teilchen, konstante Temperatur, konstante Fließgeschwindigkeit, ein nicht überladener linearer Adsorptionsbereich und möglichst regelmäßige Packungen. Die Van-Deemter-Gleichung beschreibt die Abhängigkeit von der linearen Fließgeschwindigkeit u_x:

H = A + B/u_x + C · u_x.

Der A-Term beschreibt Eddy-Diffusion durch unterschiedliche Fließwege, mit A = 2 · p · d; p ist der Packungsfaktor und d der Teilchendurchmesser. Der B-Term beschreibt longitudinale Diffusion in beide Richtungen, mit B = 2 · D · L; D ist die Diffusionskonstante in der mobilen Phase und L der Labyrinthfaktor der Porenstruktur. Der C-Term erfasst die Peakverbreiterung durch langsamen Gleichgewichtsaustausch zwischen den Phasen.

Ideale Peaks haben die Form einer Gaußschen Glockenkurve, reale Peaks besitzen jedoch Breite und häufig Asymmetrie. Ist der vordere Anstieg steiler als der Abfall, spricht man von Tailing; ist der Anstieg flacher als der Abfall, von Fronting oder Leading. Der Tailingfaktor wird meist bei 10 % der Peakhöhe aus den Abständen zur Peakfront und zum Peakende bestimmt, wobei unterschiedliche Formeln, etwa nach IUPAC oder USP, gebräuchlich sind. Der ideale Gauß-Peak hat den Wert 1; Werte über 1 bedeuten Tailing, Werte unter 1 Fronting.