Dünnschichtchromatographie

Prinzip und Bedeutung

Die Dünnschichtchromatographie (DC; englisch TLC für thin layer chromatography) ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren zur Untersuchung der Zusammensetzung von Proben. Sie eignet sich für Stoffe, die ausreichend stabil sind und sich in Lösung bringen lassen. Typische Anwendungen sind die Prüfung der Reinheit einer Substanz, der Vergleich mit einer Referenzsubstanz und die Verfolgung chemischer Reaktionen.

Die Trennung beruht auf der unterschiedlichen Verteilung der Probenteilchen zwischen zwei Phasen. Die mobile Phase ist ein Lösungsmittel, das sich bewegt; die stationäre Phase ist eine feststehende, feinporige Schicht. Moleküle oder Ionen wechseln aufgrund ihrer Wärmebewegung fortlaufend zwischen beiden Phasen. In der mobilen Phase bewegen sie sich mit dem Laufmittel, an die stationäre Phase gebunden stehen sie still. Dieses Verhalten wird als „Stop-and-go“-Modell beschrieben. Je größer der Zeitanteil eines Stoffes in der mobilen Phase ist, desto schneller und weiter wandert er.

Für eine gute Trennung müssen die Teilchen häufig zwischen beiden Phasen wechseln. Diffusion verbreitert dagegen die Stoffzonen. Sowohl eine zu geringe als auch eine zu hohe Geschwindigkeit des Laufmittels verschlechtert die Trennung: Bei geringer Geschwindigkeit bleibt mehr Zeit für Diffusion, bei hoher Geschwindigkeit wechseln die Teilchen zu selten zwischen den Phasen. Die optimale Geschwindigkeit wird durch die Van-Deemter-Gleichung beschrieben.

Die räumliche Trennung der Komponenten wächst proportional zur gesamten Laufstrecke, während die statistisch bedingte Verbreiterung der Zonen nur mit der Wurzel der Laufstrecke zunimmt. Bei schwierigen Trennungen können daher größere Platten und Laufstrecken sinnvoll sein. Auf einer Laufstrecke von 15 cm erreicht die DC etwa 400–3000 theoretische Böden, ein Maß für die Trennleistung.

Stationäre und mobile Phase

Die stationäre Phase besteht aus einer dünnen, gleichmäßigen Schicht eines feinkörnigen Materials auf einer Folie oder Platte aus Kunststoff, Aluminiumblech oder Glas. Häufig wird Kieselgel verwendet. Weitere geeignete Materialien sind Kieselgur, Aluminiumoxid, Magnesiumsilikat, Polyamid und Cellulose.

Kieselgel besitzt freie endständige Hydroxygruppen und wirkt daher als polares Adsorbens, also als Material, an dessen Oberfläche Probenmoleküle gebunden werden. Der mittlere Porendurchmesser liegt meist zwischen 4 und 100 nm; besonders gebräuchlich ist Kieselgel 60 mit 6 nm Porendurchmesser. Kieselgel enthält Siloxan- und Silanol-Gruppen.

Bei der Normalphasen-DC ist die stationäre Phase polar. Als Laufmittel dienen gewöhnlich Gemische aus unpolaren und mäßig polaren organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Petrolether und Essigsäureethylester. Die Adsorptionskapazität von Kieselgel nimmt in folgender Reihenfolge ab: –COOH > –OH > –NH₂ > –SH > –CHO > R₂C=O > CO₂R > –OCH₃ > –HC=CH–. Carbonsäuren und Alkohole werden deshalb stark festgehalten und besitzen geringe Rf-Werte; in einem wenig polaren Laufmittel können sie am Start verbleiben.

Bei der Umkehrphasen-DC („reversed phase“) trägt das Kieselgel unpolare Haftstellen. Als mobile Phase werden polare Laufmittel wie Acetonitril und Wasser eingesetzt. Gegenüber der Normalphase kehrt sich die Reihenfolge um: Polare Moleküle wandern schneller, unpolare werden stärker zurückgehalten. Über das Mischungsverhältnis lässt sich die Polarität des Laufmittels einstellen.

Spezielle Phasen erlauben besondere Trennungen. Silbernitrat-DC trennt geometrische und Positions-Isomere mit Doppelbindungen. Mit dem Kupfer-Komplex eines chiralen Derivats von L-Prolin beschichtete Umkehrphasenplatten können Enantiomere durch chirale Ligandenaustauschchromatographie trennen. Für bestimmte Anwendungen werden Platten vor Gebrauch mit Lösungsmittel gewaschen oder im Exsikkator beziehungsweise Trockenschrank getrocknet.

Praktische Durchführung

Die Probe wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und mit einer Kapillare punkt- oder strichförmig aufgetragen. Bei einer eindimensionalen DC liegt die Auftragstelle auf der Startlinie, bei einer zweidimensionalen DC in einer Ecke. Üblich sind etwa 5–20 Mikrogramm Substanz. Die Auftragzone soll nur wenige Millimeter breit sein, weil große Flecken die Trennung verschlechtern. Konzentrationszonen können ungenau aufgetragene Proben beim Durchgang der Lösungsmittelfront an der Startlinie bündeln. Für reproduzierbare quantitative Arbeiten lässt sich die Lösung maschinell mit Druckluft oder Stickstoff aufsprühen. Anschließend muss die Platte trocknen, da Lösungsmittelreste das Ergebnis verändern können. Häufig werden zusätzlich reine Vergleichssubstanzen oder Vergleichsmischungen aufgetragen.

Zur Entwicklung stellt man die Platte senkrecht in eine geschlossene Chromatographiekammer. Der Flüssigkeitsspiegel muss unterhalb der Startlinie liegen. Die Atmosphäre wird mit dem Laufmittel gesättigt, damit Verdunstung die Rf-Werte nicht erhöht; ein eingelegtes Filterpapier kann die Sättigung verbessern.

Das Laufmittel steigt durch Kapillarkräfte in der stationären Phase auf. An der Startlinie löst es die Probe. Jede Komponente wird unterschiedlich stark von stationärer und mobiler Phase angezogen und wandert deshalb unterschiedlich weit. Bei einer Normalphasen-DC gilt: Je unpolarer das Laufmittel und je polarer der Stoff, desto weniger weit wandert er. Kurz bevor die Laufmittelfront den oberen Plattenrand erreicht, nimmt man die Platte heraus und trocknet sie möglichst schnell.

Nachweis und Auswertung

Getrennte Stoffe können sichtbar gemacht werden, wenn sie selbst gefärbt sind, unter UV-Licht absorbieren oder fluoreszieren. Sie können auch vor der Trennung mit Chromophoren versehen oder danach mit Nachweisreagenzien besprüht beziehungsweise in diese eingetaucht werden.

Viele Platten enthalten fluoreszierende Zusätze, vor allem mit Mangan aktiviertes Zinksilikat für 254 nm oder Calciumwolframat für 366 nm. Absorbiert ein Probenstoff das UV-Licht, erreicht weniger Strahlung den Fluoreszenzfarbstoff; der Stoff erscheint als dunkler Fleck auf grün oder blau leuchtendem Hintergrund. Streng genommen handelt es sich deshalb nicht um eine echte Fluoreszenzlöschung. Aromatische Verbindungen sind beispielsweise bei 254 nm meist gut sichtbar, gesättigte Kohlenwasserstoffe und viele Aminosäuren dagegen nicht. Auch Eigenfluoreszenz oder Radioaktivität können zum Nachweis dienen.

Sprüh- und Tauchreagenzien wie NBD-Cl, Molybdatophosphorsäure oder 2,7-Dichlorfluorescein erzeugen empfindliche, teilweise für bestimmte funktionelle Gruppen spezifische Farbreaktionen. Allgemein wirksame Verfahren sind unter anderem die Oxidation mit Salpetersäurelösung und die Behandlung mit Ioddampf. Beim Iodnachweis bilden sublimierte Diiodmoleküle kurzlebige lilafarbene oder braune Komplexe mit den Stoffflecken. Aminosäuren werden in der Biochemie häufig mit saurer Ninhydrin-Lösung nachgewiesen; dabei entsteht über eine Schiffsche Base sowie durch Decarboxylierung und Hydrolyse Ruhemans Violett.

Zur qualitativen Identifizierung vergleicht man die Lage eines Flecks mit gleichzeitig entwickelten Referenzstoffen. Der Retentions- oder Rückhaltefaktor Rf („ratio of fronts“) ist das Verhältnis der Laufstrecke der Substanz S zur Laufstrecke des Laufmittels L: Rf = S/L. Bei gleichem Plattenmaterial und gleicher Laufmittelzusammensetzung ist er eine Stoffkonstante. Beim Rst-Wert wird die Laufstrecke eines Substanzflecks durch die Laufstrecke eines meist reinen Standards geteilt.

Eine quantitative Bestimmung ist mit einem Densitometer möglich. TLC-Scanner messen im sichtbaren und ultravioletten Spektralbereich sowie teilweise die Fluoreszenz; auch Flachbettscanner können densitometrisch genutzt werden. Durch direkte Kopplung der DC mit der Massenspektrometrie lassen sich getrennte Komponenten anhand ihres Massenspektrums zuverlässig identifizieren.

Erweiterte Verfahren

Die Hochleistungsdünnschichtchromatographie ist eine Weiterentwicklung der gewöhnlichen linearen DC. Weitere Varianten dienen besonders der Trennung komplexer Gemische oder der Gewinnung gereinigter Stoffe.

Bei der zweidimensionalen DC wird die Platte nach der ersten Entwicklung getrocknet, um 90° gedreht und meist mit einem anderen Laufmittel erneut entwickelt. Dadurch lassen sich Multikomponentengemische besser trennen. Die Identifizierung ist jedoch schwieriger, weil keine Referenzsubstanzen gleichzeitig mitlaufen können. Vor der zweiten Entwicklung kann die Platte zusätzlich behandelt werden, etwa mit UV-Licht. Eine solche Abfolge aus Transport, Reaktion und erneutem Transport heißt TRT-Technik.

Bei der zirkularen Dünnschichtchromatographie, kurz CLC oder RPC, rotiert eine runde Glasscheibe mit ringförmig aufgebrachter stationärer Phase kontrolliert durch einen Elektromotor. Eine Pumpe führt Probe und Laufmittel am inneren Rand zu. Die Probe wird in ringförmige Zonen getrennt, die durch die Fliehkraft nach außen wandern. Fluoreszierende Zusätze in der stationären Phase ermöglichen die Beobachtung unter UV-Licht bei 254 oder 366 nm.

Die präparative Dünnschichtchromatographie (PLC) dient nicht nur der Analyse, sondern der Reinigung kleiner Substanzmengen. Auf Glasplatten mit bis zu 2 mm dicken Schichten werden bis zu 100 mg Substanzgemisch als Linie aufgetragen. Nach der Trennung schabt man die Schicht mit der gewünschten Substanz ab und löst diese mit einem geeigneten Lösungsmittel aus der stationären Phase; dieser Vorgang heißt Elution. Auch analytische Platten können genügend Material für empfindliche Verfahren wie Massen- oder Infrarotspektrometrie liefern. Bei der präparativen zirkularen DC wird die Zielkomponente am äußeren Rand zusammen mit dem Laufmittel aufgefangen. Für größere Mengen wird heute eher die Flash-Chromatographie verwendet.

Stärken, Grenzen und Entwicklung

Die DC ist schnell, vielseitig und preiswert. Sie benötigt wenig Substanz und nur einen geringen apparativen Aufwand, bietet aber eine hohe Trennleistung. Im Unterschied zur Gaschromatographie müssen die Proben nicht unzersetzt verdampfbar sein. Gegenüber Säulenverfahren lassen sich auch Proben mit Stoffgruppen stark unterschiedlicher Polarität gut überblicken.

Ein Laufmittelwechsel ist weniger einfach als bei der Säulenchromatographie, aber nach einer ersten Entwicklung und Zwischentrocknung kann ein deutlich anders polares Laufmittel verwendet werden. Die quantitative Analyse war lange schwieriger als bei leistungsfähigeren Methoden wie Gaschromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Moderne Densitometer ermöglichen inzwischen jedoch quantitative Auswertungen, die den Richtlinien der Guten Laborpraxis genügen. Für Aufgaben wie die Beobachtung eines Reaktionsfortschritts reicht häufig bereits eine Abschätzung der Mengenverhältnisse.

Historisch führten N. A. Izmailov und M. S. Shraiber 1938 eine Trennung auf einer horizontalen Dünnschichtplatte durch. Größere Aufmerksamkeit erhielt die Methode ab 1951 durch Justus G. Kirchner und seine Mitarbeiter. Egon Stahl beschrieb später die Herstellung leistungsfähiger Platten, verhalf dem Verfahren zum Durchbruch und prägte den Namen Dünnschichtchromatographie.