Auflösung (Mikroskopie)

Was ist Auflösung in der Mikroskopie?

Unter optischer oder räumlicher Auflösung versteht man in der Mikroskopie den Abstand, den zwei Strukturen mindestens haben müssen, um nach der optischen Abbildung noch als getrennte Bildstrukturen wahrgenommen zu werden. Betrachtet wird z. B. der minimale Abstand zweier punktförmiger Objekte oder der minimale Linienabstand in einem optischen Gitter.

Die klassische Lichtmikroskopie ist fundamental begrenzt, weil die optischen Nahfelder um das Objekt nicht durch das optische System übertragen werden. Dieser minimale Objektabstand heißt Auflösungsgrenze oder Abbe-Limit; Ernst Abbe beschrieb die Beziehung im 19. Jahrhundert. Techniken, die diese Grenze deutlich unterbieten, werden zusammenfassend Superresolution-Mikroskopie genannt, z. B. RESOLFT/STED, SIM, STORM und das optische Rasternahfeldmikroskop.

Es gibt drei rechnerisch sehr ähnliche Ansätze zur Bestimmung der Auflösung: Abbe betrachtete beleuchtete (passive) Gitterstrukturen, Lord Rayleigh punktförmige Lichtquellen (aktive Objekte), und ein dritter Ansatz nutzt die Halbwertsbreite des mikroskopischen Signals einer Punktlichtquelle.

Um die theoretische Auflösung zu erreichen, muss genügend Licht gesammelt werden. Bei Hellfeldmikroskopie ist das unproblematisch; bei Fluoreszenzmikroskopie können zu wenige Photonen am Detektor ankommen, sodass der Kontrast nicht ausreicht.

Von der Auflösung zu unterscheiden sind Nachweisbarkeit und Positionierungsgenauigkeit: Mit Dunkelfeldmikroskopie (Ultramikroskopie) oder Fluoreszenzmikroskopie lassen sich noch einzelne Farbstoffmoleküle nachweisen, die weit unter der Auflösungsgrenze liegen. Die Position eines Helligkeitsmaximums lässt sich mit Nanometergenauigkeit bestimmen. Die Auflösungsgrenze gilt trotzdem: Es lässt sich nicht feststellen, ob Licht von einem Punkt oder von mehreren nahen Punkten stammt.

Abbe-Limit: Herleitung und Formeln

Abbe untersuchte 1873 die Beugung von Licht an Strichgittern. Je dichter die Gitterlinien beieinander liegen, desto stärker wird das Licht gebeugt. Bei zentraler Beleuchtung (Licht fällt senkrecht auf das Gitter) muss das Objektiv außer dem Hauptmaximum mindestens das erste Nebenmaximum des Beugungsmusters auffangen, um die Gitterstruktur abzubilden. Ist das nicht mehr möglich, wird die Struktur nicht mehr aufgelöst.

Abbe selbst schrieb, dass die Unterscheidungsgrenze für zentrale Beleuchtung niemals nennenswert über eine ganze Wellenlänge des blauen Lichts und für äußerste schiefe Beleuchtung (Kondensor, der das Licht als Strahlkegel auftrifft lässt) niemals über eine halbe Wellenlänge hinausgehen wird. Kurzwelliges (blaues) Licht wird weniger stark gebeugt als langwelliges (rotes) und erlaubt daher bessere Auflösung. Das Abbe-Kriterium ist mit klassischer Mikroskopie absolut nicht überwindbar. Die Überlegungen gelten für beleuchtete Objekte (kohärente Beleuchtung), nicht für selbstleuchtende Objekte und nicht für die Auflösung entlang der optischen Achse (z-Richtung).

Formeln (d = minimaler erkennbarer Linienabstand, λ = Wellenlänge, n = Brechungsindex des Immersionsmediums, α = halber Öffnungswinkel des Objektivs):

• Zentrale Beleuchtung (ohne Kondensor): d = λ / (n·sin α) = λ / NA(Objektiv).
• Objektiv mit kleinerer NA als Kondensor („äußerste schiefe Beleuchtung“, Kondensor-NA mindestens so groß wie Objektiv-NA): d = λ / (2n·sin α) = λ / (2·NA).
• Kondensor-NA kleiner als Objektiv-NA: d = λ / (NA(Objektiv) + NA(Kondensor)). Dies ist die allgemeine Form; bei zentraler Beleuchtung ist NA(Kondensor) = 0, bei gleichen Aperturen ergibt sich 2NA. Ein optimaler Bildkontrast stellt sich bei einer Kondensor-NA von 2/3 der Objektiv-NA ein; notfalls kann die Kondensorblende zugezogen werden.

Beispiele zum Abbe-Limit

Bei gelb-grünem Licht mit 550 nm (das Auge ist hier am empfindlichsten):

• Objektiv NA 0,25 (viele 10x-Objektive), Kondensor NA 0,55: d = 550 nm / (2·0,25) = 1100 nm. Eine größere Kondensorapertur kann höchstens wie die Objektivapertur eingehen, daher mal zwei.
• Objektiv NA 0,65 (viele 40x-Objektive), Kondensor NA 0,55: d = 550 nm / (0,65 + 0,55) = 450 nm.
• Ölimmersionsobjektiv NA 1,4 mit Ölimmersionskondensor NA 1,4: d = 550 nm / (1,4 + 1,4) = 196 nm.

Rayleigh-Kriterium und axiale Auflösung

Für selbstleuchtende Strukturen (z. B. in der Fluoreszenzmikroskopie) gilt das Rayleigh-Kriterium. Seine Erstbeschreibung für die Mikroskopie wird je nach Lehrbuch Rayleigh (1896), Rayleigh und Helmholtz oder nur Helmholtz (1873/1874) zugeschrieben; es wurde aus der Astronomie bzw. vom Teleskop übertragen.

Selbstleuchtende Punkte erscheinen nicht als Punkte, sondern als Beugungsmuster (Punktspreizfunktion); die Ebene höchster Intensität heißt Beugungsscheibchen. Das Rayleigh-Kriterium besagt: Zwei nebeneinanderliegende Punkte sind gerade noch unterscheidbar, wenn das Intensitätsmaximum des ersten Beugungsscheibchens im Minimum des zweiten liegt. Die dunkle Stelle zwischen den Maxima hat dann 73,5 % der Maximalhelligkeit. Das Kriterium ist eine Konvention, kein absolutes Kriterium.

Auflösung in der Fokusebene: d = 0,61·λ / NA (auch als d = 1,22·λ / (2·NA) angegeben). Hier geht die Wellenlänge des vom Objekt abgestrahlten Lichts ein (bei Fluoreszenz also die Emissionswellenlänge), nicht die des gebeugten Lichts wie beim Abbe-Limit.

Axiale Auflösung (z-Richtung): Sie ist generell schlechter als in der Fokusebene. Für paraxiale Optik (kleine Öffnungswinkel, niedrige NA) gilt d = 2·λ·n / NA², mit n = Brechungsindex des Mediums (z. B. 1 für Luft, 1,518 für typisches Immersionsöl). Immersionsobjektive haben bei gleicher NA eine schlechtere axiale Auflösung, da n über dem Bruchstrich steht – praktisch aber selten relevant, weil Immersionsobjektive meist höhere NA haben, die im Quadrat wirkt. Für höhere Aperturen liefert die Fresnel-Huygens-Theorie realistischere Intensitätsverteilungen.

Halbwertsbreite (FWHM)

Das Rayleigh-Kriterium lässt sich rechnen, aber schwer experimentell bestimmen. Deshalb nutzt man in der Fluoreszenzmikroskopie praktisch die Halbwertsbreite (full width half maximum, FWHM) der Punktspreizfunktion (point spread function, PSF) – das dreidimensionale beugungsbedingte Abbild eines fluoreszierenden Punkts, hauptsächlich vom Objektiv bestimmt. Gemessen wird an Objekten kleiner als die Auflösungsgrenze, z. B. 150 nm großen, fluoreszenzfarbstoffgetränkten Latexkügelchen oder Quantenpunkten. Die PSF-Halbwertsbreite liegt bei etwas kleineren Werten als die Auflösung.

Formeln (klassische Fluoreszenzmikroskopie):

• Fokusebene: FWHM(x,y) = 0,51·λ / NA.
• Optische Achse: FWHM(z) = 0,88·λ / (n − √(n² − NA²)); für NA unter 0,5 genähert als FWHM(z) = 1,77·n·λ / NA².

Beispiel: Ölimmersionsobjektiv NA 1,4, λ = 550 nm: FWHM(x,y) = 0,51·550 nm / 1,4 = 200 nm; entlang der optischen Achse mit Öl n = 1,518: FWHM(z) = 520 nm.

Auflösungssteigerung in der klassischen Mikroskopie

Aus Abbe-Limit und Rayleigh-Kriterium folgt: Kleinere Auflösungswerte erreicht man durch Verkürzung der Wellenlänge λ und Vergrößerung der numerischen Apertur NA.

Verkürzung der Wellenlänge: Anfang des 20. Jahrhunderts entwickelte August Köhler ab 1900 bei Zeiss die UV-Mikroskopik. Mit halbierter Wellenlänge verdoppelte sich die Auflösung. Da das Auge UV-Licht nicht sieht, war die Darstellung nur per Film oder Fluoreszenzschirm möglich; zudem müssen Linsen und Objektträger aus Quarzglas, Flussspat oder Lithiumfluorid bestehen, weil normales Glas UV absorbiert. Daher blieb die UV-Mikroskopie Spezialanwendungen vorbehalten. Ein Nebeneffekt von Köhlers Versuchen war die Entdeckung der Fluoreszenzmikroskopie.

Steigerung der numerischen Apertur: NA = n · sin α. Wegen der endlichen Frontlinse und des nötigen Arbeitsabstands ist sin α immer kleiner als 1; hochwertige Objektive erreichen 0,95. n lässt sich durch Immersion (Flüssigkeit zwischen Präparat und Objektiv) steigern: Luft ≈ 1, Wasser 1,33, typisches Immersionsöl 1,518 – Ölimmersion steigert die Auflösung um über 50 %. Weit verbreitet sind Ölimmersionsobjektive mit NA = 1,4 (100× oder 60×); auch Ölimmersionskondensoren erreichen NA 1,4. Monobromnaphthalin (n = 1,666, von Abbe eingeführt) ermöglichte Objektive mit NA 1,63, die aber für biologische Durchlichtmikroskopie ungeeignet waren, da auch Objektträger, Deckglas, Einbettungsmedium und Objekt einen mindestens so hohen Brechungsindex bräuchten. Heute erreichen spezielle Ölimmersionsobjektive für TIRF-Mikroskopie NA = 1,45.