Fluoreszenzmikroskopie

Prinzip und physikalische Grundlagen

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Form der Lichtmikroskopie, bei der das Bild ausschließlich aus Fluoreszenzlicht des Präparats entsteht. Fluoreszierende Moleküle absorbieren Anregungslicht bestimmter Wellenlängen und senden kurz darauf Licht längerer Wellenlängen aus. Diese Verschiebung zum roten Ende des Spektrums heißt Stokes-Verschiebung. Filter halten das Anregungslicht vom Bild fern, sodass markierte Strukturen hell vor dunklem Hintergrund erscheinen.

Bei der Anregung hebt ein absorbiertes Photon ein Elektron vom Grundzustand S₀ in einen angeregten Zustand S₁. Beide Zustände besitzen Unterzustände unterschiedlicher Schwingungsenergie. Nach nichtstrahlender Energieabgabe fällt das Elektron vom niedrigsten angeregten Niveau zurück und sendet wenige Nanosekunden nach der Absorption ein Photon aus. Nach der Kasha-Regel erfolgt die Fluoreszenz grundsätzlich vom niedrigsten angeregten Energieniveau. Das Emissionsspektrum ist daher unabhängig von der genauen Anregungswellenlänge. Die charakteristische zeitliche Verteilung bis zur Emission heißt Fluoreszenzlebensdauer.

Die anregenden beziehungsweise emittierten Wellenlängen bilden das Anregungs- und Emissionsspektrum. Fluorescein wird beispielsweise am wirksamsten bei etwa 490 nm angeregt und leuchtet am stärksten bei 520 nm. Fluoreszierende Stoffe heißen Fluorophore; zum Anfärben eingesetzte Fluorophore werden Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluorochrome genannt.

Jedes fluoreszierende Molekül wirkt wie eine eigene Lichtquelle. Deshalb können auch Strukturen unterhalb der klassischen Auflösungsgrenze nachgewiesen werden. Die klassische Fluoreszenzmikroskopie kann nahe Signale jedoch nicht als getrennte Strukturen erkennen und überwindet die Auflösungsgrenze somit nicht.

Fluoreszenzmarkierung und Farbkanäle

Eigenständig leuchtende Bestandteile erzeugen Autofluoreszenz, auch Eigen- oder Primärfluoreszenz genannt. Pflanzen zeigen häufig starke Autofluoreszenz; Chlorophyll fluoresziert rot. Tierische Zellen leuchten schwächer, können künstliche Markierungen aber dennoch überdecken. Wichtige Quellen sind Flavine in Mitochondrien, Lipofuscin in Lysosomen und NADPH. Künstlich erzeugte Sekundärfluoreszenz entsteht durch Fluoreszenzmarkierung.

Gute Fluorochrome absorbieren Licht mit hoher Wahrscheinlichkeit, wandeln möglichst viele absorbierte Photonen in Fluoreszenz um, bleichen langsam aus und besitzen ein schmales Emissionsspektrum. Dadurch können mehrere Strukturen gleichzeitig verschiedenfarbig markiert werden. Stark überlappende Spektren sind nicht unterscheidbar. Typischerweise regt UV-Licht blau, blaues Licht grün und grünes Licht rot fluoreszierende Stoffe an. Übliche Mikroskope besitzen drei bis fünf Farbkanäle; in einem beschriebenen Verfahren wurden acht Fluorochrome parallel verwendet.

In den Lebenswissenschaften binden manche Farbstoffe direkt an bestimmte Strukturen, etwa DAPI, Acridinorange und Hoechst 33342 an DNA oder Nilrot und DiI an Membranen. Bei der Immunfluoreszenz binden fluoreszenzmarkierte Antikörper an ihre Zielstrukturen. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung weist größere DNA-Abschnitte mit markierten Gensonden nach; fluoreszierendes Phalloidin färbt Aktin.

Proteine können gentechnisch mit fluoreszierenden Proteinen wie GFP verbunden werden. So lassen sich ihre Verteilung, Zellbestandteile und Proteinwechselwirkungen auch in lebenden Zellen untersuchen. Zelltyp-spezifische Promotoren können Fluoreszenz auf bestimmte Zelltypen begrenzen. Zustandsabhängige Sonden zeigen unter anderem Calciumkonzentrationen, Membranspannungen, Redox-Potentiale oder pH-Werte an. Ein typisches Mehrfarbenbild kann DNA blau mit DAPI, Mikrotubuli grün mit einem FITC-markierten Antikörper und Aktinfilamente rot mit Phalloidin-TRITC darstellen.

Aufbau und Bildaufnahme

Heute wird fast ausschließlich das Epifluoreszenz- oder Auflichtprinzip verwendet: Das Objektiv beleuchtet das Präparat und sammelt zugleich dessen Fluoreszenz. Ein Anregungsfilter lässt nur die benötigten Anregungswellenlängen passieren. Ein dichroitischer Strahlteiler reflektiert dieses Licht durch das Objektiv zum Präparat, lässt aber das längerwellige Fluoreszenzlicht in Richtung Okular oder Detektor hindurch. Ein Sperr- oder Emissionsfilter entfernt verbliebenes reflektiertes Anregungslicht. Die drei Bauteile sind meist in einem austauschbaren Filterblock zusammengefasst.

Da nur ein kleiner Teil des Anregungslichts absorbiert wird, sind lichtstarke Quellen nötig. Verwendet werden Quecksilberdampf-, Halogenmetalldampf- und Xenon-Gasentladungslampen sowie seit dem 21. Jahrhundert LED-Lampen. Filter wählen aus ihrem Spektrum die benötigten Wellenlängen aus.

Interferenzfilter bestehen aus mehreren dünnen Schichten und lassen durch Interferenz bestimmte Wellenlängen passieren, während sie andere spiegeln. Ihre Wirkung hängt vom Einfallswinkel ab. Ein Kurzpass KP480 lässt Licht bis 480 nm durch, ein Langpass LP520 Licht oberhalb von 520 nm. Ein Bandpass 525/50 überträgt 500–550 nm. Multi-Bandpassfilter und Multi-Dichroics bedienen mehrere Farbkanäle ohne Filterwechsel. In manchen Laserscanningmikroskopen übernehmen akustooptische Modulatoren entsprechende Aufgaben; Emissionslicht kann mit Prisma oder Beugungsgitter spektral zerlegt werden.

Helle Fluoreszenz ist bis etwa 620 nm direkt durch das Okular sichtbar. Zur Dokumentation dienen meist elektronische Kameras, häufig empfindliche Schwarzweiß-CCD-Kameras. Verschiedene Farbkanäle werden nacheinander aufgenommen und am Computer überlagert; ihre Darstellungsfarben können frei gewählt werden.

Grenzen und Fehlerquellen

Fluorochrome können durch Anregungslicht photochemisch zerstört werden; dieser Vorgang heißt Photobleichung. Neben Fluoreszenz und nichtstrahlender innerer Umwandlung kann ein angeregtes Molekül aus einem Singulett-Zustand in einen langlebigen Triplett-Zustand T₁ übergehen. Dieser als Intersystem Crossing bezeichnete Übergang wird aus höheren angeregten Zuständen S₂ oder darüber wahrscheinlicher. Aus Triplett-Zuständen kann Phosphoreszenz entstehen, besonders häufig erfolgen jedoch chemische Reaktionen. Molekularer Sauerstoff O₂ ist wegen seines Triplett-Grundzustands besonders reaktiv und fördert das Bleichen.

Antifade-Substanzen beziehungsweise Antioxidantien wie para-Phenylamin-Diamin, DABCO oder Gallate können Bleichen verringern, aber nicht verhindern. Daher sind photostabile Fluorochrome und eine möglichst geringe Belichtung wichtig.

In lebenden Zellen können reaktive Sauerstoffspezies Zellbestandteile schädigen und Zellen töten. Reduzierende Stoffe wie Ascorbinsäure oder Trolox können helfen. Kurzwelliges Licht, besonders UV-Licht, schädigt Zellen auch direkt. Für Lebendbeobachtungen sind UV-freie LEDs, Laser oder Halogenlampen vorteilhaft. Empfindliche Detektoren sowie Fokussieren mit Hellfeld, Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast verkürzen die Fluoreszenzbelichtung. Zu hohe Konzentrationen der Markierungssubstanzen können Zellen außerdem direkt vergiften.

Bei Mehrfachmarkierungen kann ein Signal in einen benachbarten Farbkanal gelangen. Dieses Übersprechen heißt bleedthrough oder crosstalk und entsteht besonders durch das langsam abfallende langwellige Ende vieler Emissionsspektren. Enge Bandpassfilter und eine nacheinander statt gleichzeitig ausgeführte Anregung vermindern den Effekt.

Spezialverfahren und höhere Auflösung

Bei der Lichtscheibenmikroskopie beleuchtet ein seitliches Lichtblatt nur eine dünne Ebene. Dadurch entsteht außerhalb dieser Ebene keine unscharfe Hintergrundfluoreszenz; Kontrast und gegebenenfalls axiale Auflösung steigen.

Konfokale Mikroskope rastert das Präparat punktweise ab. Eine Lochblende blockiert Licht ober- und unterhalb der Schärfeebene, sodass kontrastreiche optische Schnitte entstehen. Bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie treffen zwei Photonen nahezu gleichzeitig auf ein Fluorophor. Gepulste Laser mit 700–1200 nm erzeugen die nötige Photonendichte. Das längerwellige Licht dringt wegen geringerer Absorption und Streuung tiefer in biologisches Gewebe ein.

Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie erzeugt kein Bild: Ein feststehender Laser beobachtet ein kleines Volumen. Helligkeitsschwankungen durch ein- und austretende Moleküle liefern deren Diffusionsgeschwindigkeit und können beispielsweise Proteinbindungen anzeigen. FLIM unterscheidet Fluorophore anhand ihrer Fluoreszenzlebensdauer; sie beträgt etwa 3,25 ns für Fluorescein, 3,41 ns für Texas Red und 1,1 ns für Eosin.

Beim Förster-Resonanzenergietransfer, FRET, überträgt ein angeregter Donor seine Energie direkt auf einen Akzeptor. Dafür müssen beide weniger als 10 nm voneinander entfernt sein und das Emissionsspektrum des Donors muss das Anregungsspektrum des Akzeptors überlappen. Die Effizienz nimmt mit der sechsten Potenz des Abstands ab. FRET weist deshalb direkte molekulare Nachbarschaft weit unterhalb der Auflösungsgrenze nach.

Das Abbe-Limit liegt bei guten Mikroskopen mit Ölimmersion abhängig von der Wellenlänge bei etwa 200 nm. Konfokalmikroskopie verbessert die theoretische Auflösung nur um den Faktor √2 ≈ 1,41. TIRF regt durch eine evaneszente Welle lediglich eine 100–200 nm dicke Schicht nahe dem Deckglas an. Echte Superresolution-Verfahren überwinden die Beugungsgrenze deutlicher: STED verkleinert das fluoreszierende Volumen durch ringförmige stimulierte Abregung; strukturierte Beleuchtung rekonstruiert aus Moiré-Mustern ein Bild mit bis zu zweifacher Auflösung. Bei der Lokalisationsmikroskopie leuchtet jeweils nur ein kleiner Teil der Fluorophore; oft werden über tausend Bilder zu einem Gesamtbild zusammengesetzt. Varianten sind PALM, STORM, dSTORM, GSD und DNA-Paint.

FRAP bleicht einen Zellbereich kurzzeitig und misst die Rückkehr ungebleichter Moleküle. FLIP bleicht einen Bereich fortlaufend und misst den Fluoreszenzverlust im übrigen Zellraum. Beide Verfahren liefern Informationen über Diffusion und Bindungsverhalten.

Anwendungen und Entwicklung

In den Materialwissenschaften wird meist natürliche Autofluoreszenz genutzt. In Verbundwerkstoffen können fluoreszierende Bindemittel von nicht fluoreszierenden Fasern unterschieden werden; konfokale Fluoreszenz lässt sich dazu mit Reflexionsmikroskopie kombinieren. Untersucht werden außerdem organische Fasern in Papier, Holz und Bast sowie organische und Perowskit-Solarzellen. Bei Kohle machen fluoreszierende, lipidreiche Liptinite organischen Ursprungs Unterschiede zu nicht fluoreszierenden anorganischen Bestandteilen sichtbar. Ihre Fluoreszenzeigenschaften verändern sich während der Kohleentstehung.

Die ersten Beobachtungen machte August Köhler 1904 unbeabsichtigt bei der UV-Mikroskopie. Das erste kommerzielle Fluoreszenzmikroskop entwickelte Oskar Heimstädt; Reichert stellte es 1911 vor. Michail Tswett beschrieb 1911 die Fluoreszenz von Chloroplasten, Stanislaus von Prowazek setzte 1913 Eosin und Neutralrot als Fluoreszenzfarbstoffe ein.

Ab 1933 entwickelte Max Haitinger Fluoreszenzfärbungen und prägte die Begriffe Primärfluoreszenz, Sekundärfluoreszenz und Fluorochrom. 1942 koppelten Albert Hewett Coons und Kollegen Fluorescein-Isocyanat an Antikörper und begründeten die Immunfluoreszenz. J. L. Riggs und Kollegen verbesserten sie 1958 mit den stabileren Farbstoffen FITC und Rhodamin-B-isothiocyanat.

Johan Sebastiaan Ploem trieb in den 1960er-Jahren die Einführung von Interferenzfiltern und dichroitischen Strahlteilern voran. Damit konnten Fluorochrome mit UV-, violettem, blauem oder grünem Licht durch das Objektiv angeregt werden. Um 1972 enthielt der PLOEMOPAK vier austauschbare Filterwürfel mit jeweils Anregungsfilter, Strahlteiler und Sperrfilter. Damit war das Grundprinzip des heutigen Epifluoreszenzmikroskops abgeschlossen. Ab den 1990er-Jahren entstanden zahlreiche Superresolution-Verfahren; William Moerner, Eric Betzig und Stefan Hell erhielten dafür 2014 den Nobelpreis für Chemie.