Dunkelfeldmikroskopie

Grundprinzip und Bedeutung

Die Dunkelfeldmikroskopie ist eine seit über 250 Jahren bekannte Variante der Lichtmikroskopie. Sie erzeugt einen dunklen Bildhintergrund, vor dem Strukturen hell erscheinen. Dadurch können durchsichtige oder sehr kontrastarme Präparate sichtbar gemacht werden, ohne sie vorher zu färben. Auch lebende Objekte lassen sich gut beobachten. Bis zur Entwicklung der Phasenkontrastmikroskopie in den 1930er Jahren war sie, neben Rheinbergbeleuchtung und schiefer Beleuchtung, eine wichtige Methode zur Kontrastverstärkung bei ungefärbten Präparaten.

Das Prinzip beruht darauf, dass Objekte Licht nicht nur absorbieren, sondern auch ablenken, etwa durch Streuung, Beugung, Brechung oder Reflexion. Bei Dunkelfeldbeleuchtung wird die Beleuchtung so eingestellt, dass direktes, nicht abgelenktes Licht am Objektiv vorbeigeht. Nur Licht, das im Präparat abgelenkt wurde, gelangt in das Objektiv. Deshalb bleibt der Hintergrund dunkel, während lichtablenkende Strukturen hell erscheinen. Eine Ursache solcher Ablenkung ist die Mie-Streuung an kleinen Teilchen; ähnlich wird Staub in einem Lichtstrahl als Tyndall-Effekt sichtbar.

Die Beleuchtung kann als Durchlicht von der Rückseite des Präparats, als Auflicht von der Objektivseite oder seitlich erfolgen. Durchlicht- und Auflicht-Dunkelfeld sind sowohl in normalen Mikroskopen als auch in Stereomikroskopen möglich. Die Begriffe Hellfeld und Dunkelfeld werden auch außerhalb der Lichtmikroskopie verwendet, zum Beispiel in der Elektronenmikroskopie und der Akustischen Mikroskopie: Hellfeld bedeutet, dass das nicht abgelenkte Signal registriert wird; Dunkelfeld bedeutet, dass nur ein durch die Probe verändertes Signal zur Bildgebung beiträgt.

Hellfeld und Dunkelfeld im Vergleich

Bei der Durchlicht-Hellfeldmikroskopie, der häufigsten Form in Biologie, Medizin und Schulmikroskopen, tritt Licht durch das Präparat und gelangt direkt in das Objektiv. Der Kontrast entsteht vor allem dadurch, dass Teile des Präparats Licht absorbieren und dadurch dunkler erscheinen. Viele mikroskopische Objekte sind jedoch weitgehend durchsichtig oder sehr klein und absorbieren wenig Licht. Im Hellfeld sind sie deshalb oft nur schwach vor dem hellen Hintergrund zu erkennen.

Bei der Durchlicht-Dunkelfeldmikroskopie wird das Präparat von hinten so beleuchtet, dass das direkte Licht nicht in das Objektiv gelangt. Nur abgelenktes Licht trägt zum Bild bei. Dadurch werden transparente Proben oft besonders deutlich sichtbar. Ein Beispiel im Artikel ist ein Fingerabdruck auf einem Objektträger: Im Dunkelfeld sind die feinen Fettspuren gut zu erkennen, während Partikel und Kratzer sehr hell und teilweise überstrahlt erscheinen.

Für Durchlicht-Dunkelfeld müssen Objektträger, Deckglas und Glasflächen im Mikroskop sehr sauber sein, weil jedes Staubkorn Licht ablenkt und als Störsignal sichtbar wird. Dickere Präparate, etwa typische Gewebeschnitte, sind ungeeignet, wenn lichtablenkende Strukturen in mehreren Ebenen übereinanderliegen und sich ihre Signale überlagern. Physikalisch lässt sich Durchlicht-Dunkelfeld so beschreiben, dass das Beugungshauptmaximum nicht in die hintere Brennebene des Objektivs gelangt; nur abgelenktes Licht, zum Beispiel Beugungs-Nebenmaxima, bildet das Bild.

Bei Auflichtbeleuchtung fällt Licht von oben, also von der Objektivseite, auf das Präparat. Im Auflicht-Hellfeld erscheint eine glatte, stark reflektierende Oberfläche hell, ähnlich wie beim normalen Sehen. Im Auflicht-Dunkelfeld wird das Licht so seitlich eingestrahlt, dass gerichtete Reflexionen am Objektiv vorbeigehen. Glatte reflektierende Flächen erscheinen dunkel, während Kanten, Kratzer, Defekte und Auflagerungen hell hervortreten. Das ist besonders nützlich bei Materialuntersuchungen und Oberflächenkontrollen.

Technische Umsetzung

In heutigen Durchlichtmikroskopen wird Dunkelfeldbeleuchtung meist so erzeugt, dass das Präparat mit einem Licht-Kegelmantel beleuchtet wird. Der innere Teil des Kegels enthält kein Licht. Der Kondensor fokussiert den Kegelmantel in die Präparatebene; nicht abgelenktes Licht geht danach am Objektiv vorbei. Nur im Präparat abgelenktes Licht gelangt in das Objektiv. Voraussetzung ist, dass die numerische Apertur des Kondensors größer ist als die des Objektivs. Die numerische Apertur beschreibt, welchen Lichtkegel ein optisches System aufnehmen oder abgeben kann und hängt mit der erreichbaren Auflösung zusammen. Ohne Immersion ist die Anwendung meist auf Objektive mit numerischer Apertur von etwa 0,75 oder weniger beschränkt; ein häufiges 40x-Trockenobjektiv hat etwa 0,65.

Eine einfache Methode ist die Zentralblende. Sie ist in der Mitte lichtundurchlässig und am Rand ringförmig lichtdurchlässig. In einem normalen Durchlichtmikroskop erzeugt sie mit dem Kondensor einen Beleuchtungskegel, dessen direktes Licht am Objektiv vorbeigeht. Zentralblenden sind einfach, preisgünstig und besonders für kleinere Vergrößerungen geeignet. Teilweise lassen sich Ringblenden aus der Phasenkontrastmikroskopie als Dunkelfeldblenden zweckentfremden, wenn sie eigentlich für Objektive mit deutlich größerer numerischer Apertur gedacht sind.

Für höhere Bildqualität werden spezielle Dunkelfeldkondensoren verwendet. Trockendunkelfeldkondensoren eignen sich für Objektive mit numerischen Aperturen bis etwa 0,65 oder 0,75. Immersionsdunkelfeldkondensoren verwenden Öl oder Wasser zwischen Kondensor und Objektträger, erreichen höhere numerische Aperturen und können bis etwa 1,2 verwendet werden. Sie liefern besseren Kontrast, sind aber aufwändiger zu handhaben und zu reinigen. Moderne Dunkelfeldkondensoren sind oft Kardioidkondensoren, bei denen Spiegel einen ringförmigen Lichtkegel erzeugen. Paraboloidkondensoren erzeugen den Kegelmantel durch Totalreflexion.

Auch Stereomikroskope können Dunkelfeld verwenden. Bei Durchlicht-Dunkelfeld befindet sich die Beleuchtung meist im Stativfuß; Spiegel und eine zentrale Abdeckung erzeugen einen Kegelmantel. Bei Auflicht-Dunkelfeld im Stereomikroskop wird Licht streifend auf die Oberfläche gerichtet, sodass gerichtete Reflexionen das Objektiv nicht direkt erreichen. Spezielle Ringleuchten können allseitige Dunkelfeldbeleuchtung erzeugen; im Artikel wird ein Abstrahlwinkel von etwa 60° und ein Abstand von 5–15 mm über der Probe genannt.

Besondere Formen und Nachweis kleiner Teilchen

Die Rheinbergbeleuchtung ist eine Abwandlung der Dunkelfeldmikroskopie mit Zentralblende. Sie wurde 1896 von Julius Rheinberg beschrieben. Statt einer einfachen Zentralblende wird ein runder Filter mit zwei Farben verwendet: Der äußere Ring färbt das abgelenkte Licht, der mittlere Bereich färbt den Hintergrund. Dadurch entstehen farbige, oft ästhetische Bilder, ohne dass zusätzliche Strukturen sichtbar werden. Mit dreifarbigen Rheinbergfiltern können Streurichtungen unterschiedlich eingefärbt werden, etwa bei Diatomeen oder Textilgewebe.

Ein wichtiger Vorteil der Dunkelfeldmikroskopie ist der Nachweis sehr kleiner Teilchen. Die Signalstärke hängt nicht direkt von der Größe einer Struktur ab, sondern davon, wie stark sie Licht ablenkt. Darum können auch Partikel sichtbar werden, die kleiner sind als die Auflösungsgrenze des Mikroskops. Man sieht dann aber kein echtes Abbild ihrer Form, sondern eine Beugungserscheinung, die als Punktspreizfunktion bezeichnet wird. Auch kann man nicht sicher erkennen, ob ein Signal von einem Teilchen oder von mehreren dicht beieinanderliegenden Teilchen stammt. Die Form der Teilchen, etwa rund, länglich oder kantig, ist aus solchen Signalen nicht bestimmbar.

Um 1900 wurde für die Untersuchung solcher „Ultramikronen“ der Begriff Ultramikroskopie verwendet. Gemeint waren Teilchen kleiner als die Auflösungsgrenze des Lichts, also kleiner als 0,2 Mikrometer. Bereits 1902 wurden in Goldrubingläsern mit hellem Sonnenlicht Partikel unter vier Nanometern nachgewiesen. Das von Henry Siedentopf und Richard Zsigmondy entwickelte Spaltultramikroskop wurde zur Untersuchung von Kolloiden genutzt. Dabei wurde eine seitliche, ebene Beleuchtung verwendet, ähnlich dem Prinzip einer Lichtscheibe. Richard Zsigmondy stellte 1912 zusammen mit der Firma R. Winkel GmbH ein Immersionsultramikroskop vor.

Ein weiteres spezielles Verfahren ist Sidestream Dark Field Imaging, abgekürzt SDF. Es dient der Untersuchung der Mikrozirkulation, also kleiner und kleinster Blutgefäße, zum Beispiel unter der Zunge. Grünes Licht von Leuchtdioden mit 530 nm wird ringförmig eingestrahlt. Hämoglobin in roten Blutkörperchen absorbiert dieses grüne Licht stark, sodass Blutgefäße als dunkle Strukturen vor erhelltem Hintergrund erscheinen. Die maximale Eindringtiefe ins Gewebe liegt bei 500 Mikrometern.

Stärken, Grenzen und Anwendungen

Die Durchlicht-Dunkelfeldbeleuchtung hat mehrere Vorteile: Kleine und ungefärbte Objekte können mit starkem Kontrast beobachtet werden, besonders bei dünnen Präparaten und geringer Konzentration. Auch Objekte unter der Auflösungsgrenze können Signale liefern, wenn die Beleuchtung stark genug ist. Manche einfache Formen, besonders bei niedriger Vergrößerung, lassen sich mit geringem Aufwand und wenig Kosten realisieren. Außerdem treten bei Dunkelfeldbeleuchtung keine entoptischen Erscheinungen wie „Mouches volantes“ auf, also Schlieren im Glaskörper des Auges.

Die Grenzen sind ebenfalls wichtig. Homogene Innenbereiche eines Objekts erzeugen oft kein Signal; sichtbar wird dann vor allem die Umrandung, an der sich der Brechungsindex ändert. Dicke Präparate oder Präparate mit vielen Objekten sind ungünstig, weil Streulicht aus verschiedenen Ebenen den Dunkelfeld-Effekt stört. Verunreinigungen im Strahlengang erzeugen ebenfalls helle Störsignale. Für hohe Ansprüche sind spezielle Kondensoren nötig. Außerdem ist die Auflösung gegenüber Hellfeld und anderen kontrastverstärkenden Methoden wie Phasenkontrast und Differentialinterferenzkontrast reduziert, weil die Apertur des Kondensors erhöht oder die Apertur des Objektivs verringert werden muss.

Heute ist die Dunkelfeldmikroskopie wegen dieser Grenzen weniger verbreitet als manche andere Kontrastverfahren, bleibt aber für spezielle Aufgaben wichtig. In der klinischen Mikrobiologie dient sie weiterhin zum Nachweis bestimmter Krankheitserreger, etwa Spirochaeten. Sie kann auch zur Untersuchung isolierter Organellen und Polymere wie Flagellen, Cilien, Mikrotubuli und Aktinfilamente genutzt werden. Beim Millikan-Versuch ermöglicht Dunkelfeldtechnik die Beobachtung von Öltröpfchen; Robert Andrews Millikan erhielt für die Bestimmung der Elementarladung eines Elektrons 1923 den Nobelpreis für Physik.

In der Halbleiterindustrie wird Auflicht-Dunkelfeldmikroskopie zur Oberflächenkontrolle von Wafern eingesetzt, um Schmutzpartikel zu finden. Die Untersuchungen erfolgen mit Trockenobjektiven; die Auflösungsgrenze liegt dort bei etwa 0,35 Mikrometern, doch auch kleinere Partikel können sichtbar werden. In der Metallografie hilft Dunkelfeld, Kratzer, Risse, Einschlüsse, Poren, Lunker, Ausbrüche und Korngrenzen sichtbar zu machen. Bei Hobbymikroskopikern ist die Methode wegen ihrer kontrastreichen und ästhetischen Bilder verbreitet, zum Beispiel zur Beobachtung durchsichtiger Wasserkleinstlebewesen.

Abgrenzung zur Alternativmedizin

In der Alternativmedizin wird Dunkelfeldmikroskopie teilweise als Diagnoseverfahren bei Blutuntersuchungen angeboten. Dabei sollen angeblich viele Erkrankungen erkannt werden, oft verbunden mit dem Verkauf von Nahrungsergänzungsmitteln oder anderen Therapeutika. Laut Artikel beruht diese Diagnosetechnik auf der Annahme, dass bestimmte Krankheiten sichtbare Phänomene in frischem Blut hervorrufen, etwa eine Erythrozyten-Aggregation. Die Methode wird als weder plausibel noch verlässlich beschrieben; es können falschpositive oder falschnegative Diagnosen entstehen.

Nach Günther Enderlein, im Zusammenhang mit der Isopathie, sollte Dunkelfeldmikroskopie eine Krebsfrüherkennung ermöglichen. Diese Annahme beruht laut Artikel auf wissenschaftlich nicht haltbaren Vorstellungen zur Morphologie von Mikroorganismen, dem sogenannten Pleomorphismus. Eine wissenschaftliche Studie kam 2005 zu dem Schluss, dass Dunkelfeldmikroskopie zur Erkennung von Krebs ungeeignet ist. Auch die Dunkelfeldblutdiagnostik nach von Brehmer, die auf Wilhelm von Brehmer zurückgeht und ebenfalls Krebs früh erkennen soll, ist nicht belegt. Dabei wird nach Propionibacterium acnes gesucht, einem typischen Bestandteil der Hautflora, der bei der Blutabnahme leicht in den Ausstrich gelangen kann.