Southern Blot

Grundprinzip und Zweck

Der Southern Blot (auch Southern-Blot-Hybridisierungsverfahren) ist eine 1975 von Edwin M. Southern entwickelte molekularbiologische Methode zum Nachweis einer bestimmten Gensequenz in einem komplexen DNA-Gemisch, etwa im gesamten Genom eines Organismus. Dafür müssen nicht alle Sequenzen des Gemischs entschlüsselt werden.

Die DNA wird zunächst mit Restriktionsenzymen in Fragmente geschnitten, nach ihrer Größe getrennt und auf eine Membran übertragen. Eine markierte Sonde bindet anschließend nur an die dazu komplementäre Zielsequenz. Nach dem Abwaschen ungebundener oder unspezifisch gebundener Sonde wird die Bindungsstelle sichtbar gemacht.

DNA vorbereiten und nach Größe trennen

Meist wird genomische DNA aus Zellen isoliert und mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen behandelt. Wie viele nachweisbare Fragmente entstehen, hängt davon ab, wie oft die gewählten Enzyme innerhalb der gesuchten Sequenz schneiden: Ohne Schnittstelle entsteht eine Bande, bei einem Schnitt zwei Banden. Bei ringförmigen Plasmiden entstehen zwei Banden erst bei zwei Schnittstellen.

Dies gilt, wenn die Zielsequenz nur einmal in der genomischen DNA vorkommt oder sich die Sequenzen eines diploiden Organismus nicht in ihrer Fragmentlänge unterscheiden. Bei quantitativen Untersuchungen kann die Signalstärke Hinweise auf die Kopienzahl geben. Bei transgenen Organismen können die Zahl der Signale auf die Zahl der Integrationsorte und die Signalintensität auf die Zahl der Integrate hinweisen.

Gelelektrophorese und Transfer

Nach der Vorbehandlung werden 5 µg bis 30 µg DNA zusammen mit einem Marker in einem Agarosegel nach Größe getrennt. Weil Restriktionsenzyme statistisch über die DNA verteilt schneiden, entstehen Fragmente jeder Größe. Die DNA erscheint daher zunächst als gleichmäßig verteilter Schmier statt als einzelne Banden.

Das mit Ethidiumbromid angefärbte Gel wird zusammen mit einem fluoreszierenden Lineal neben dem Marker unter UV-Licht fotografiert. So lässt sich später aus der Laufstrecke die Molekülmasse der nachgewiesenen Fragmente bestimmen, denn der Marker ist nach der Sondendetektion nicht mehr sichtbar. Vor dem Transfer wird das Gel nacheinander mit stark verdünnter Salzsäure, einer Denaturierungslösung und einer Neutralisierungslösung behandelt.

Übertragung und Blockierung

Beim Blotting wird DNA aus dem Gel auf eine meist aus Nylon oder Nitrocellulose bestehende Membran übertragen. Dabei bleibt die DNA in den Maschen der Membran hängen und wird anschließend dauerhaft fixiert.

Beim Kapillar-Blot zieht ein Flüssigkeitsstrom aus einer meist alkalischen Pufferlösung von unten durch Gel und Membran in saugfähiges Material. Die alkalische Lösung trennt die DNA erneut in Einzelstränge. Das Verfahren dauert meist 10 bis 12 Stunden; durch ein 15 × 15 cm großes Gel können dabei bis zu 2 Liter Salzlösung laufen. Luftblasen dürfen im Aufbau nicht vorhanden sein, weil sie den Strom und damit den DNA-Transfer unterbrechen.

Beim Vakuum-Blot erzeugt Unterdruck den Flüssigkeitsstrom; er ist schneller und benötigt weniger Salzlösung. Beim Elektro-Blot wandert die negativ geladene DNA in einer Salzlösung von einer Kathodenplatte durch das Gel zur Anodenplatte und bleibt auf der dazwischenliegenden Membran hängen. Nach dem Transfer wird die Membran in niedrig konzentriertem Salzpuffer geschwenkt und per UV-Vernetzung (Crosslinking) fixiert; alternativ wird sie 2–3 Stunden bei 80 °C „gebacken“.

Bei der Blockierung oder Prähybridisierung werden freie DNA-Bindungsstellen der Membran abgesättigt. Dazu wird meist hitzedenaturierte Lachs- oder Heringssperma-DNA verwendet, beispielsweise in zehnfach konzentrierter Denhardt-Lösung mit SDS (1 % m/V) in Phosphatpuffer, 50 Mikrogramm pro Milliliter, fünf Stunden bei 42 °C. SDS vermindert unspezifische Bindungen von Nicht-DNA-Molekülen. Die Blockierung verhindert eine starke Hintergrundfärbung durch unspezifische Sondenbindung.

Sonde, Hybridisierung und Detektion

Die Sonde ist zur Zielsequenz komplementär und kann aus einzelsträngiger RNA bestehen, deren RNA-DNA-Hybride stabiler als DNA-DNA-Hybride sind. Alternativ wird doppelsträngige DNA-Sonde verwendet, die vor der Hybridisierung denaturiert werden muss. DNA-Sonden entstehen enzymatisch durch PCR, Random Priming oder Nick translation; dabei werden Markierungsbausteine eingebaut. RNA-Sonden werden durch in-vitro-Transkription mit Bakteriophagen-RNA-Polymerasen wie der T7-RNA-Polymerase hergestellt.

Bei der α-³²P-dATP-Markierung wird radioaktives ³²P tragendes dATP in DNA-Sonden eingebaut; bei RNA-Sonden werden ATP, GTP, CTP und α-³²P-UTP eingesetzt. Die Sonde sendet Betastrahlung aus. Auf einem Röntgenfilm schwärzen sich die Stellen mit gebundener Sonde. Als digitale Alternative dient eine Röntgenspeicherfolie, deren Leuchtstoffschicht durch Strahlung angeregt wird und die mit einem Phosphorimager ausgelesen, regeneriert und wiederverwendet werden kann.

Bei der DIG-Markierung wird dUTP statt dTTP eingebaut; daran hängt Digoxigenin. Bei RNA wird DIG-UTP verwendet. Ein spezifischer anti-DIG-Antikörper mit gekoppeltem Enzym löst eine Licht- oder Farbreaktion aus; Chemolumineszenz wird mit Fotopapier nachgewiesen. Der Vorteil ist der Verzicht auf radioaktives Material. Weitere chemische Systeme sind beispielsweise Biotin/Streptavidin. Chemische Marker sind gegenüber radioaktiver Markierung weniger sensitiv, werden aber etwa genutzt, wenn kein Isotopenlabor verfügbar ist.

Für die Hybridisierung wird eine DNA-Sonde, in der Regel 50 µl DNA-Lösung, direkt vorher auf 94 °C erhitzt. Die Einzelstränge werden mit 5 bis 10 ml Hybridisierungslösung und der Membran in einer Glasröhre mehrere Stunden bei 40 bis 60 °C automatisch gewendet. Die Bedingungen sollen bewirken, dass die Sonde nur an die Zielsequenz bindet. Die Temperatur hängt von Sondenlänge, G/C-Gehalt und Salzkonzentration ab: Tm = 81,5 °C + 0,41 × (%G/C) + 16,6 log [Na+] − 500/n − 0,61 * (%Formamid), wobei n die Anzahl der Sondenbasen ist. Danach wird die Membran mehrmals mit niedrig konzentrierten Salzlösungen bei bis zu 65 °C gewaschen und je nach Markierung detektiert.

Sonde entfernen und verwandte Blots

Beim Stripping wird die spezifisch gebundene Sonde nach der Detektion entfernt. Die Membran wird dazu in Stripping-Lösung mehrere Minuten auf 94 °C erhitzt. Dadurch brechen die Basenpaarungen zwischen Sonde und Zielsequenz auf. Nach erneuter Prähybridisierung kann dieselbe Membran mit einer anderen Sonde untersucht werden. Abhängig von übertragener DNA-Menge sowie Membran- und Lösungsqualität kann dies bis zu 20 Mal wiederholt werden.

Der Northern Blot überträgt zuvor elektrophoretisch getrennte RNA auf eine Membran und dient zur Überprüfung des Expressionsstatus eines Gens. Beim Western Blot werden Proteine mittels PAGE (Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese) getrennt und mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Far-Western-Blotting untersucht Protein-Interaktionen, indem der jeweilige Ligand per Antikörper detektiert wird. Die Kombination aus Western und Southern Blot heißt Southwestern Blot.