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Lichtmikroskop
Lichtmikroskope (von griechisch μικρόν mikrón „klein“; σκοπεῖν skopein „betrachten“) sind Mikroskope, die stark vergrößerte Bilder von kleinen Strukturen …
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Grundprinzip und Bildentstehung
Ein Lichtmikroskop erzeugt mithilfe von Licht stark vergrößerte Bilder kleiner Strukturen oder Objekte. Die Vergrößerung beruht auf der Lichtbrechung an Glaslinsen. Damit Einzelheiten erkennbar werden, braucht das Bild neben ausreichender Vergrößerung und Auflösung auch genügend Kontrast.
Einfache Mikroskope besitzen nur ein optisches System und funktionieren wie eine Lupe. Für eine starke Vergrößerung benötigen sie eine Linse mit sehr kurzer Brennweite und entsprechend kleinem Durchmesser. Sie muss dicht vor das Auge gehalten werden, was die Benutzung anstrengend macht. Antoni van Leeuwenhoek erreichte mit solchen Geräten mehr als 200-fache Vergrößerungen; für seine Mikroskope werden auch bis zu 270-fache Vergrößerungen angegeben. Varianten verwendeten Edelsteinlinsen mit hohem Brechungsindex oder Kombinationen aus zwei beziehungsweise drei Plankonvexlinsen, sogenannte Doublets und Triplets, um Abbildungsfehler zu verringern.
Moderne Geräte sind meist zusammengesetzte Mikroskope. Sie besitzen mindestens zwei hintereinander angeordnete optische Systeme. Das Objektiv erzeugt zunächst ein vergrößertes reelles Bild, das Zwischenbild. Das Okular wirkt anschließend wie eine Lupe und erzeugt ein nochmals vergrößertes virtuelles Bild. Die Gesamtvergrößerung ist das Produkt aus Objektiv- und Okularvergrößerung. Ein 20×-Objektiv und ein 10×-Okular ergeben daher 200×. Moderne Objektive und Okulare bestehen aus mehreren Linsen, um Abbildungsfehler wie die chromatische Aberration, also Farbfehler, auszugleichen.
Bauformen und Bauteile
Zu einem typischen zusammengesetzten Durchlichtmikroskop gehören Objektiv, Okular, Tubus, Objekttisch, Objektträger, Kondensor und Lichtquelle. Mehrere Objektive sitzen meist in einem drehbaren Objektivrevolver und lassen sich schnell wechseln. Häufige Objektivvergrößerungen liegen zwischen 10× und 100×; viele Okulare vergrößern 10×. Der Tubus ist die Röhre zwischen Objektiv und Okular. Das Präparat liegt gewöhnlich auf einem gläsernen Objektträger, der am Objekttisch befestigt wird. Der Kondensor ist ein Linsensystem, das das von unten kommende Licht auf das Objekt richtet. Zum Scharfstellen kann der Objekttisch auf und ab bewegt werden; der Kondensor bewegt sich dabei mit. Als Lichtquelle dient bei alten und sehr einfachen Geräten ein Spiegel, sonst meist eine elektrische Lichtquelle.
Bei der Durchlichtmikroskopie gelangt das Licht von hinten durch das Präparat zum Objektiv. Dafür muss das Präparat durchsichtig oder dünn geschnitten sein. Ein typisches Beispiel ist die häufig verwendete Durchlicht-Hellfeldmikroskopie. Bei der Auflichtmikroskopie fällt das Licht durch das Objektiv oder von der Seite auf das Präparat; das reflektierte Licht wird vom Objektiv aufgefangen. So lassen sich auch undurchsichtige Proben untersuchen, etwa geschliffene, polierte oder angeätzte Materialoberflächen. Auflicht durch das Objektiv ist zudem in der Fluoreszenzmikroskopie verbreitet, während Stereomikroskope meist seitlich beleuchtet werden.
Beim aufrechten Mikroskop befindet sich das Objektiv über dem Präparat; dies ist die häufigere Bauart. Beim inversen oder umgekehrten Mikroskop liegt das Objektiv darunter. Diese Anordnung eignet sich besonders für lebende Zellkulturen, deren Zellen sich am Boden eines Kulturgefäßes befinden. Sie wird unter anderem bei der Patch-Clamp-Technik und zusammen mit Mikromanipulatoren eingesetzt.
Bei der klassischen Endlichoptik ist das Objektiv auf eine feste Tubuslänge abgestimmt, meist 160 mm; Leitz/Wetzlar verwendete auch 170 mm. Bei der Unendlichoptik verlassen parallele Lichtstrahlen das Objektiv. Dadurch können Filter, Strahlteiler und andere Elemente in den Strahlengang eingefügt werden. Erst eine Tubuslinse erzeugt das reelle Zwischenbild. Solche Objektive tragen gewöhnlich das Zeichen ∞.
Beleuchtung des Präparats
Zwei wichtige Verfahren sind die kritische und die Köhlersche Beleuchtung. Die historisch ältere kritische Beleuchtung wird noch bei manchen einfachen Mikroskopen verwendet. Dabei bildet der Kondensor die Lichtquelle verkleinert in der Präparatebene ab. Bei einer Glühlampe erscheint dort also die Glühwendel. Das liefert maximale Helligkeit, kann aber die Erkennung von Strukturen stören. Ein Mattglasfilter oder ein leicht abgesenkter Kondensor macht das störende Bild unscharf. Bei Tageslicht und Spiegelbeleuchtung können sich sonst sogar Umgebungsstrukturen wie Fensterrahmen abbilden.
Die von August Köhler entwickelte und 1893 veröffentlichte Köhlersche Beleuchtung ist Standard in Routine- und Forschungsmikroskopen. Sie erzeugt ein gleichmäßig helles Gesichtsfeld und beleuchtet nur den tatsächlich beobachteten Bereich, wodurch störendes Streulicht vermindert wird. Die Lichtquelle wird nicht in der Präparatebene, sondern in der Ebene der Kondensor- oder Aperturblende abgebildet. In der Präparatebene erscheint dagegen das Bild der Leuchtfeld- oder Feldblende. Köhlersche Beleuchtung erfordert eine künstliche Lichtquelle.
Beim Köhlern wird zuerst das Präparat scharf gestellt. Danach wird die Leuchtfeldblende geschlossen und der Kondensor so in der Höhe verstellt, dass ihr Rand scharf erscheint. Falls nötig, wird der Kondensor zentriert. Schließlich öffnet man die Leuchtfeldblende gerade so weit, dass ihr Rand nicht mehr sichtbar ist. Im Abbildungsstrahlengang sind Leuchtfeldblende, Präparatebene, Zwischenbild und Netzhaut des Beobachters konjugierte Ebenen, werden also gleichzeitig scharf abgebildet. Im Beleuchtungsstrahlengang gilt dies für Lichtquelle, Kondensorblende, hintere Brennebene des Objektivs und Pupille.
Kontrastverfahren
Viele biologische Präparate, etwa Gewebeschnitte oder kleine Wasserlebewesen, besitzen von sich aus wenig Kontrast. In der Hellfeldmikroskopie entstehen Helligkeitsunterschiede durch farbige oder dunkle Strukturen im durchleuchteten Präparat; bei Bedarf wird der Kontrast durch künstliche Färbung verstärkt.
Bei farblosen Objekten können besondere Verfahren Unterschiede des Brechungsindex in Helligkeitsunterschiede umwandeln. Dazu gehören Dunkelfeldmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie, Differentialinterferenzkontrast und schiefe Beleuchtung. Die Polarisationsmikroskopie nutzt Unterschiede im Polarisationsverhalten. Fluoreszenzmikroskopie setzt fluoreszierende Strukturen voraus. Weitere Verfahren sind Interferenzreflexionsmikroskopie, Kathodolumineszenzmikroskopie, Ultramikroskopie, Lichtscheibenmikroskopie (SPIM), Konfokalmikroskopie beziehungsweise konfokale Laserscanningmikroskopie (CLSM) und Multiphotonenmikroskopie einschließlich der Zwei-Photonen-Mikroskopie.
Auflösung und besondere Anwendungen
Die Auflösung bezeichnet die Fähigkeit, nahe beieinanderliegende Strukturen getrennt darzustellen. Sie ist für erkennbare Einzelheiten wichtiger als eine bloß hohe Vergrößerung. Bei optimalen Geräten und Öl-Immersion kann die klassische Lichtmikroskopie Objekte unterscheiden, die mindestens etwa 0,2 bis 0,3 µm voneinander entfernt sind. Diese Grenze beruht auf der Wellennatur des Lichts und hängt unter anderem von dessen Wellenlänge sowie von der numerischen Apertur (NA) des Objektivs ab.
Ernst Abbe gab für die förderliche Vergrößerung die Beziehung V_M = 500…1000 · NA an. Bei dieser Vergrößerung erscheinen die kleinsten vom Objektiv aufgelösten Strukturen dem Auge etwa unter einem Winkel von 2′, also zwei Bogenminuten. Eine darüber hinausgehende Vergrößerung macht das Bild größer, zeigt aber keine zusätzlichen Einzelheiten. Objektiv und Okular müssen deshalb aufeinander abgestimmt sein.
Seit den 1990er Jahren ermöglichen vor allem fluoreszenzmikroskopische Methoden aufgrund nichtlinearer Farbstoffeigenschaften Auflösungen jenseits des Abbe-Limits. Dazu zählen STED, PALM und STORM, 3D-SIM, 4Pi-Mikroskopie, TIRF, Vertico-SMI mit SPDMphymod-Technologie sowie optische Rasternahfeldmikroskopie (SNOM). Bereits 1971 veröffentlichten Thomas Cremer und Christoph Cremer Berechnungen zu einem idealen 4π-Hologramm, das ein Interferenzfeld in allen Raumrichtungen festhalten sollte.
Für besondere Aufgaben existieren eigene Bauformen: Ein Stereomikroskop besitzt getrennte Strahlengänge für beide Augen und erzeugt dadurch einen räumlichen Eindruck. Ein Messmikroskop erlaubt die Vermessung von Präparaten. Operationsmikroskope werden im Operationssaal, Trichinoskope zum Nachweis von Trichinen bei der Fleischbeschau und Strichmikroskope als Ablesevorrichtungen an Theodoliten eingesetzt. Vibrationsmikroskope untersuchen Saitenschwingungen. Computer-Mikroskope können beispielsweise über USB mit einem Computer verbunden werden, der das Bild anzeigt.
Historische Entwicklung
Vergrößerungslinsen waren bereits im 16. Jahrhundert bekannt. Hans Janssen und Zacharias Janssen gelten häufig als Erfinder des ersten zusammengesetzten Mikroskops von 1590; diese Zuordnung beruht jedoch auf einer späteren Aussage von Zacharias Janssen und das Datum ist fragwürdig, da er selbst erst 1590 geboren wurde. Galileo Galilei entwickelte 1609 das zusammengesetzte Mikroskop Occhiolino. Eine Bienenzeichnung Francesco Stellutis von 1630 gilt als älteste überlieferte Zeichnung, die mithilfe eines Mikroskops entstand.
Robert Hooke veröffentlichte 1665 seine Micrographia. Mit seinem zusammengesetzten Auflichtmikroskop entdeckte er Zellen; wegen sich verstärkender Abbildungsfehler erreichte er sinnvoll höchstens etwa 50-fache Vergrößerung. Antoni van Leeuwenhoek verwendete dagegen sorgfältig geschliffene Einzellinsen. Seine unhandlichen, aber leistungsfähigen einfachen Mikroskope ermöglichten die Beobachtung einzelliger Bakterien und Protozoen, die er „Animalkulen“ nannte. Robert Brown entdeckte 1830 mit einem einfachen Mikroskop den Zellkern und die Brownsche Molekularbewegung.
Bis weit ins 19. Jahrhundert entstanden zusammengesetzte Mikroskope hauptsächlich durch Erfahrung und Ausprobieren. Um 1873 erarbeitete Ernst Abbe die noch heute gültigen physikalischen Grundlagen für den Mikroskopbau. Gemeinsam mit Carl Zeiss entstanden Objektive, deren Auflösung nicht mehr von der Materialqualität, sondern von den Beugungsgesetzen begrenzt wurde: dem Abbe-Limit. Dabei waren auch die von Otto Schott entwickelten optischen Gläser und August Köhlers Beleuchtungsverfahren wichtig.
