Isotherme Titrationskalorimetrie

Zweck und messbare Größen

Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC; englisch isothermal titration calorimetry) ist eine biophysikalische, quantitative Messmethode zur Untersuchung biochemischer Bindungsprozesse. Meist wird analysiert, wie kleine Moleküle, sogenannte Liganden, etwa medizinisch wirksame Substanzen, an größere Makromoleküle wie Proteine oder DNA binden.

Die Methode charakterisiert die Energetik einer Bindung und liefert außerdem Aussagen über Zahl und Verhältnis der beteiligten Teilchen. Bestimmt werden können die Assoziationskonstante Kₐ als Bindungskonstante, die Reaktionsenthalpie ΔH sowie die Bindungsstöchiometrie n. Die Stöchiometrie beschreibt das Verhältnis, in dem Ligand und Makromolekül an der Interaktion beteiligt sind.

Aus diesen Werten lassen sich die Gibbs’sche Reaktionsenergie ΔG⁰ und die Reaktionsentropie ΔS⁰ unter Standardbedingungen berechnen:

ΔG⁰ = −RT ln Kₐ = ΔH⁰ − TΔS⁰

Dabei ist R die Gaskonstante und T die absolute Temperatur.

Aufbau der Apparatur

Ein isothermes Titrationskalorimeter besitzt zwei Zellen aus identischem, gut wärmeleitendem Material, beispielsweise Gold oder Hastelloy. Sie liegen in einer adiabatisch ummantelten Zelle, also in einer Umgebung, die den Wärmeaustausch nach außen möglichst gering hält. Empfindliche Thermoelemente messen die Temperatur der Flüssigkeiten in den Zellen sehr genau.

Eine Zelle ist die Referenzzelle und enthält Wasser oder eine Pufferlösung. Die andere ist die Probenzelle mit dem zu untersuchenden Makromolekül. Das Flüssigkeitsvolumen beträgt je Zelle 0,2–1,4 ml. Beide Zellen befinden sich in einer kühleren Umgebung und werden mit einer konstanten Leistung, meist unter 1 mW, beheizt. Ein Rückkopplungsmechanismus reguliert die Heizungen abhängig von der gewünschten Temperatur.

In der Probenzelle befindet sich eine Titrationsspritze. Mit ihr wird der Ligand schrittweise zugegeben. Ligand und Makromolekül müssen sich in exakt demselben Puffer bei gleichem pH-Wert befinden. Dadurch werden unspezifische Mischungswärmen möglichst klein gehalten.

Messablauf bei der Bindung

Während des Experiments werden genau bekannte Ligandenmengen nacheinander in die Probenzelle injiziert. Die Bindung kann Wärme an die Flüssigkeit abgeben oder ihr Wärme entziehen. Das Gerät hält die Temperatur dennoch konstant und misst dazu die Differenz zwischen den Heizleistungen von Probenzelle und Referenzzelle.

Bei einer exothermen Reaktion wird bei der Bindung Wärme frei. Die Lösung in der Probenzelle erwärmt sich; deshalb muss weniger Energie zugeführt werden, damit Proben- und Referenzzelle exakt gleich temperiert bleiben. Bei einer endothermen Reaktion kühlt die Lösung in der Probenzelle ab. Dann ist eine höhere Heizleistung erforderlich. Die jeweilige Anpassung der Energiezufuhr übernimmt der Rückkopplungsmechanismus.

Thermogramm und Auswertung

Die Messdaten werden als Leistung in μcal/s oder µW gegen die Zeit in s dargestellt. Diese Aufzeichnung heißt Thermogramm. Es besteht typischerweise aus einer Folge von Zacken, den Spikes. Jeder Spike gehört zu einer Ligandeninjektion sowie der anschließenden Temperaturänderung und Wiederherstellung der konstanten Temperatur durch den Rückkoppler.

Die Fläche unter einem Spike entspricht der Wärmemenge, die bei der jeweiligen Injektion aufgenommen oder frei wird. Sie wird durch Integration über die Zeit bestimmt. Anschließend werden die Bindungswärme-Effekte in Abhängigkeit vom molaren Verhältnis Ligand/Makromolekül ausgewertet. Daraus können die thermodynamischen Parameter der untersuchten Interaktion bestimmt werden.

Vor dem Experiment sollten die Proben unter Vakuum entgast werden. Luftblasen in den Zellen können die Messung stören und abnorme Spektren verursachen.