Säulenchromatographie

Grundprinzip und Zweck

Säulenchromatographie (SC, englisch column chromatography) ist ein chromatographisches Trennverfahren. Definitionsgemäß befindet sich die stationäre Phase, also das ruhende Material, an dem Stoffe zurückgehalten werden können, in einem zylindrischen Rohr, der Trennsäule. Dieses Packungsmaterial kann den ganzen Innenraum des Rohres ausfüllen; dann spricht man von einer gepackten Säule. Es kann auch nur als dünne Schicht auf der Innenfläche liegen; dieser Fall kommt bei der analytischen Kapillargaschromatographie vor.

Die Definition der Säulenchromatographie legt nicht fest, welche mobile Phase verwendet wird. Die mobile Phase ist das Medium, das die Stoffe durch die Säule transportiert. Sie kann eine Flüssigkeit sein, wie in der Flüssigchromatographie, ein Gas, wie in der Gaschromatographie, oder ein überkritisches Medium, wie in der überkritischen Fluidchromatographie. Auch die Art der Wechselwirkung ist nicht festgelegt: Säulenchromatographie kann zum Beispiel Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie oder Größenausschlusschromatographie sein.

In der Laborpraxis meint man mit Säulenchromatographie meist flüssigkeitschromatographische Verfahren. Dabei werden Stoffgemische dadurch getrennt, dass die einzelnen Substanzen in Lösung unterschiedlich stark an einem festen Träger adsorbiert werden. Adsorption bedeutet, dass sich Teilchen an der Oberfläche eines Materials anlagern. Das Verfahren dient häufig der präparativen Reinigung von Stoffgemischen unterschiedlicher Polarität, also ihrer unterschiedlichen Verteilung von Ladung oder Teilladungen. Es kann im Mikrogramm- bis Kilogramm-Maßstab eingesetzt werden.

Stationäre Phase

Bei der manuellen Säulenchromatographie wird die stationäre Phase in der Regel für jeden Einsatz neu in ein langes Glasrohr eingebracht, also „gepackt“. Dieses Glasrohr ist am unteren Ende mit einer Fritte und einem Hahn verschlossen. Eine Fritte ist ein poröser Einsatz, der die feste Phase zurückhält, aber Flüssigkeit passieren lässt. Statt einer Fritte wird auch häufig gestopfte Watte verwendet.

Als stationäre Phase dienen meist feinpulvriges Kieselgel oder Aluminiumoxid. Diese Materialien sollen möglichst gleichmäßig in der Säule verteilt sein. Wichtig ist, dass sie ohne Luftblasen und Risse mit dem Lösungsmittel gefüllt werden, das später auch als mobile Phase dient. Eine gleichmäßige Packung ist wichtig, weil ungleichmäßige Bereiche den Fluss stören und die Trennung verschlechtern können.

Mobile Phase

Die mobile Phase ist das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, das die zu trennenden Stoffe durch die Säule transportiert. Ihre Polarität muss möglichst genau an das jeweilige Trennproblem angepasst werden. Dafür verwendet man Mischungen aus polaren und unpolaren Lösungsmitteln.

Für unpolare Substanzen sind Hexan/Ethylacetat-Mischungen gängige Laufmittelvariationen. Für polarere zu trennende Substanzen reichen typische Laufmittel von Dichlormethan/Methanol bis hin zu wässrigen Lösungen. Die Wahl der mobilen Phase beeinflusst, wie stark die Stoffe mit der stationären Phase wechselwirken und wie schnell sie durch die Säule wandern.

Ablauf der manuellen Trennung

Bei der Durchführung wird das aufzutrennende Stoffgemisch am oberen Ende der stationären Phase aufgetragen. Anschließend wird Lösungsmittel nachgefüllt. Dieses trägt das Stoffgemisch durch die Säule. Die Bestandteile werden je nach ihrer Polarität unterschiedlich stark immer wieder an der stationären Phase adsorbiert und wieder desorbiert. Desorption bedeutet, dass sich angelagerte Teilchen wieder von der Oberfläche lösen.

Weil die einzelnen Stoffe unterschiedlich lange an der stationären Phase festgehalten werden, entfernen sie sich im Strom des Lösungsmittels langsam voneinander. Im Idealfall liegen sie am Ende der Säule in getrennten Zonen vor. Das austretende Lösungsmittel mit den gelösten Stoffen heißt Eluat. Es wird in kleinen Portionen aufgefangen. Diese Portionen nennt man Fraktionen. Nach der Identifizierung, zum Beispiel mit Dünnschichtchromatographie, können passende Fraktionen vereinigt werden.

Für schwierige Trennungen kann ein Lösungsmittelgradient nötig sein. Dabei wird die Polarität der mobilen Phase während der Trennung langsam gesteigert. So werden zuerst die unpolareren Fraktionen zügig ausgetragen, während die polareren Stoffe noch weitgehend stationär bleiben. Dadurch kann man vermeiden, eine sonst nötige sehr lange und schwer handhabbare Säule zu verwenden.

Neben einer ausreichenden Länge muss die Säule auch einen zur Probenmenge passenden Durchmesser haben. Der Durchmesser soll dazu beitragen, die Startzone möglichst klein zu halten. Eine kleine Startzone verbessert die Chance, dass sich die Stoffe später klar getrennt auffangen lassen.

Automatisierte und Flash-Chromatographie

Säulenchromatographische Trennungen können beschleunigt werden, wenn die mobile Phase nicht nur durch die Schwerkraft des überstehenden Lösungsmittels durch die stationäre Phase läuft. Stattdessen kann sie mit Druckluft durch die Säule gedrückt werden. Dieses Verfahren heißt Flash-Chromatographie und wird auch medium-performance liquid chromatography, MPLC, genannt. Es wurde 1978 von W. Clark Still entwickelt.

Durch den Druck wird die Trennung nicht nur schneller. Auch die Trennleistung der Säule kann steigen, weil die Zonen weniger Zeit haben, sich durch Diffusion in Fließrichtung aufzuweiten. Diffusion bedeutet hier, dass sich Stoffzonen mit der Zeit ausbreiten und dadurch unschärfer werden.

Für die automatisierte Flash-Chromatographie gibt es kommerzielle Gerätesysteme. Sie können Gradientenpumpen, integrierte Detektoren und Fraktionssammler enthalten. Außerdem sind fertig vorgepackte Säulen als Kunststoffkartuschen erhältlich, und zwar mit verschiedenen Packungsmaterialien. Dadurch wird das Verfahren im Labor leichter standardisierbar und schneller durchführbar.