Affinitätschromatographie

Grundidee und Bedeutung

Affinitätschromatographie, gelegentlich auch Proteinaffinitätschromatographie genannt, ist ein chromatographisches Trennverfahren. Sie dient dazu, einen bestimmten Analyten – häufig ein Protein – aus einer Lösung mit verschiedenen Stoffen zu isolieren. Voraussetzung ist ein geeigneter Ligand, also ein Bindungspartner, der den gewünschten Analyten gezielt erkennt und bindet.

Das Verfahren gehört zu den leistungsfähigsten Trennmethoden, weil die Bindung sehr spezifisch sein kann. Die Säulen sind jedoch relativ kostspielig. Deshalb wird die Methode besonders in speziellen Fällen und im kleinen Maßstab, etwa im Labor, eingesetzt.

Bindung an die stationäre Phase

Die Trennung erfolgt meist in einer Säule, ist aber auch als Batchverfahren möglich. Der Reinigungseffekt beruht beispielsweise auf der spezifischen Erkennung eines Proteins durch einen Antikörper. Bei Enzymen nutzt man deren spezifische Affinität zu einem Inhibitor, Substrat oder Cofaktor.

Die stationäre Phase ist häufig ein Gel aus Dextranen oder quervernetzter Agarose, die unter dem Handelsnamen Sepharose bekannt ist. An dieses Trägermaterial wird ein Ligand gekoppelt, zum Beispiel ein Antikörper beziehungsweise Immunglobulin. Er bindet den zu reinigenden Analyten. Die Affinität darf dabei nicht zu hoch sein, weil sich der Analyt sonst schwer wieder eluieren, also von der Säule lösen lässt. Zur präparativen Reinigung von Antikörpern kann die stationäre Phase umgekehrt Protein A, G oder L tragen, das bestimmte Immunglobulinklassen bindet.

Vor dem Koppeln wird das Trägermaterial aktiviert. Bei Agarose kann die Bromcyan-Aktivierung eingesetzt werden: Dabei entstehen reaktive Imidocarbonat-Gruppen, die mit Aminogruppen des Analyten kovalente Bindungen bilden. Bei einem niedermolekularen Liganden kann ein größerer Analyt durch sterische Hinderung, also räumliche Behinderung, schlecht an die Bindungsstelle gelangen. Dann wird der Ligand über ein Brückenglied, einen Spacer, gekoppelt. Dafür verwendet man meist kurze Kohlenwasserstoffketten, die aus der Matrixoberfläche herausragen.

Wichtig ist die Assoziationskonstante K_Ass als Maß für die Bindung von Ligand und Zielprotein. Je größer sie ist, desto günstiger verläuft die Trennung; sie sollte mindestens K_Ass = 10^4 mol^−1 betragen.

Ablauf und Anwendungen

Die Affinitätschromatographie wird vor allem verwendet, um eine Substanz aus einer Mischung in einer Pufferlösung zu reinigen und zu konzentrieren oder ihre Menge in einer Mischung zu verringern. Sie kann auch zeigen, welche biologischen Verbindungen an eine bestimmte Substanz binden. Häufig dient sie außerdem zum Reinigen und Konzentrieren von Enzymlösungen.

Meist kommen biokompatible HPLC-Anlagen zum Einsatz, jedoch mit Drücken bis zu 150 bar. FPLC-Anlagen („fast protein liquid chromatography“) arbeiten oft mit weniger als 10 bar. Das Stoffgemisch wird über Probenschleifen oder Probenpumpen auf die Säule gegeben. Der gewünschte Analyt bindet an die Liganden; andere Stoffe eluieren schnell, weil sie nur schwach mit ihnen wechselwirken. Nach einem Waschschritt werden unspezifisch gebundene Verunreinigungen entfernt. Anschließend löst man den Analyten durch veränderte Bedingungen, zum Beispiel einen anderen Puffer. Häufig dienen ein saurer Puffer oder ein Lösungsmittel/Wasser-Gemisch als Elutionsmittel. Möglich sind auch kompetitiv wirkende Substanzen oder ein Überschuss freier Liganden. Das Eluat enthält den gereinigten und angereicherten Analyten.

Beim Batchverfahren ist die Vorgehensweise ähnlich, es nutzt jedoch Zentrifugation und weitere druckunabhängige Trennmethoden. Batch- und Säulenbetrieb können kombiniert werden, indem auf das Batchverfahren ein Säulenbetrieb folgt. Bei mehreren hintereinander geschalteten Säulen können teure Liganden bis zur maximalen Belegung genutzt werden: Das aus einer Säule austretende, nicht gebundene Produkt wird in einer weiteren Säule aufgefangen. Abwechselndes Beladen und Eluieren führt zu einem periodischen, oft als kontinuierliche Chromatographie bezeichneten Prozess. Zwei Säulen können dies effizient umsetzen; weitere Säulen verringern die Effizienz.

Spezielle Verfahren und Ligandenbeispiele

Spezielle Anwendungen betreffen die Aufreinigung von Nukleinsäuren, Proteinen oder Blut. Dazu gehören Immunaffinität zur Reinigung von Antikörpern aus Blutseren und die immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC). IMAC beruht auf der kovalenten Bindung von Aminosäuren, besonders Histidin, an Metallen. His-Tag und Strep-tag werden zur Aufreinigung rekombinanter Proteine eingesetzt. Lektine sind Proteine, die Kohlenhydrate binden und dadurch Substanzen in einer Probe trennen können.

Typische Zuordnungen sind: Antigene sowie Protein A, G oder L binden Antikörper; Substrate oder Kofaktoren binden Enzyme; ein Ligand bindet einen Rezeptor; Lectin bindet ein Glykoprotein; Nukleinsäure bindet ein nukleinsäurebindendes Protein. Streptavidin oder Avidin binden Biotin beziehungsweise ein Protein mit Streptavidin-Peptid. Metallionenchelate wie Ni^2+-NTA binden Proteine mit Poly-histidin-Peptid.