Real Time Quantitative PCR

Grundprinzip und Zweck

Die quantitative Echtzeit-PCR, englisch real-time quantitative PCR, kurz qPCR oder Real Time Detection PCR (RTD-PCR), ist eine Methode zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren. Sie beruht auf der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), erlaubt aber zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen DNA. Manchmal wird qPCR uneindeutig auch als qRT-PCR oder RT-qPCR bezeichnet, wenn eine reverse Transkription mit anschließender qPCR im selben Ansatz gemeint ist. Die Abkürzung RT-PCR kann jedoch zu Verwechslungen führen, weil sie auch für die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion verwendet wird.

Die Quantifizierung erfolgt über Fluoreszenz-Messungen, die während jedes PCR-Zyklus in Echtzeit erfasst werden. Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Ausgewertet wird am Ende eines Laufs anhand der Fluoreszenzsignale in der exponentiellen Phase der PCR. Nur in dieser kurzen Phase sind die Reaktionsbedingungen optimal, sodass eine korrekte Quantifizierung möglich ist. Damit unterscheidet sich die Methode von anderen quantitativen PCR-Verfahren, die erst nach Abschluss der PCR auswerten, zum Beispiel mit kompetitiver PCR und häufig nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Fragmente.

Die qPCR kann außer zur Mengenbestimmung auch für andere Zwecke eingesetzt werden, etwa zur Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Merkmalsausprägungen.

Fluoreszenzfarbstoffe

Eine einfache Möglichkeit zur Quantifizierung von PCR-Produkten ist die Verwendung von DNA-Farbstoffen wie Ethidiumbromid oder SYBR Green I. Diese Fluoreszenzfarbstoffe lagern sich in DNA ein, also interkalieren, oder binden an die kleine Furche doppelsträngiger DNA. Dadurch steigt ihre Fluoreszenz. Wenn die Menge der Ziel-DNA von Zyklus zu Zyklus zunimmt, nimmt auch die Fluoreszenz zu. Gemessen wird am Ende der Elongation in jedem Zyklus.

Der wichtigste Nachteil dieser Methode ist die geringe Spezifität: Der Farbstoff unterscheidet nicht zwischen verschiedenen PCR-Produkten. Multiplex-Messungen, also gleichzeitige Messungen mehrerer Zielsequenzen, sind damit ebenfalls nicht möglich. Die Spezifität kann nach der PCR durch eine Schmelzkurvenanalyse überprüft werden.

Bei der Schmelzkurvenanalyse wird die DNA durch langsames kontinuierliches Erhöhen der Temperatur von 50 °C auf 95 °C aufgeschmolzen. Bei einer für das Fragment spezifischen Schmelztemperatur trennt sich der Doppelstrang in zwei Einzelstränge. Dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt, und die Änderung der Fluoreszenz wird gemessen. Schmelzkurve und Schmelztemperatur hängen vor allem von Länge und Basenzusammensetzung des DNA-Fragments ab. Spezifische PCR-Produkte haben meist einen höheren Schmelzpunkt als unspezifische Primerdimere, sodass eine Unterscheidung möglich ist. Häufig wird der Absolutwert der ersten Ableitung des Fluoreszenzsignals gegen die Temperatur aufgetragen; die entstehenden Peaks sind charakteristisch für das jeweilige PCR-Produkt. Die Höhe oder ein anderes Merkmal dieser Peaks dient jedoch nicht zur Quantifizierung der DNA-Menge.

Sonden und Primer nach dem FRET-Prinzip

Eine weitere Gruppe von qPCR-Methoden nutzt den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET). Dabei wird ein Donor-Fluorochrom durch eine Lichtquelle angeregt und überträgt einen Teil seiner Energie auf ein nahe gelegenes Akzeptor-Fluorochrom oder auf einen dark Quencher. Wird der Abstand zwischen Donor und Akzeptor größer, nimmt der FRET ab. Dadurch verändert sich das Fluoreszenzsignal: Das Signal des Akzeptors nimmt ab, das des Donors nimmt zu. FRET-Verfahren sind aufwendig und teuer, bieten aber eine hohe Spezifität.

LightCycler-Sonden, auch Hybridisierungs-Sonden, verwenden zwei Oligonukleotide, die nebeneinander an die Zielsequenz binden. Eines trägt einen FRET-Donor, das andere einen FRET-Akzeptor. Durch die Nähe der beiden Fluorochrome entsteht ein messbares Signal. Gemessen wird am Ende der Annealing-Phase jedes Zyklus; anschließend kann eine Schmelzkurvenanalyse folgen.

Beim LoopTag-Sondensystem trägt der Vorwärtsprimer am 5'-Ende eine sequenzunspezifische Nukleotidsequenz und den Fluoreszenz-Akzeptor. Die LoopTag-Sonde trägt am 3'-Ende eine sequenzunspezifische Nukleotidsequenz und den Donor. Sie bindet mit ihrem 5'-Ende an die Zielsequenz und mit ihrem 3'-Ende an den verlängerten Vorwärtsprimer. Dadurch entsteht eine Sonden-Primer-Schleife, die Donor und Akzeptor in räumliche Nähe bringt.

TaqMan-Sonden, auch Hydrolyse-Sonden, sind an einem Ende mit einem Quencher und am anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff markiert, zum Beispiel TAMRA und FAM. Solange die Sonde intakt ist, unterdrückt der Quencher die Reporter-Fluoreszenz. Die Taq-Polymerase besitzt zusätzlich zur Polymeraseaktivität eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität. Während der Synthese des Gegenstrangs baut sie das 5'-Ende der Sonde ab. Reporter und Quencher entfernen sich voneinander, und eine steigende Reporter-Fluoreszenz wird messbar. Die Messung findet am Ende der Elongation jedes Zyklus statt.

Molecular Beacons sind Oligonukleotide mit Reporter-Fluorophor und Quencher. Ihre Enden sind komplementär, sodass eine Haarnadelstruktur, ein stem loop, entsteht. In diesem Zustand fluoresziert der Reporter wegen der Nähe zum Quencher nicht. Bindet die Schleifenregion an eine komplementäre DNA-Sequenz, vergrößert sich der Abstand zwischen Reporter und Quencher, und Reporter-Fluoreszenz wird sichtbar.

Scorpion-Primer verbinden Eigenschaften von Real-Time-PCR-Sonden und PCR-Primern in einem Molekül (Uni-Scorpion) oder zwei Molekülen (Bi-Scorpion). Sie besitzen ähnlich wie Molecular Beacons eine selbstkomplementäre Schaft-Region mit Reporter und Quencher sowie am 3'-Ende einen PCR-Primer. Mit steigender DNA-Konzentration bindet die Loop-Region an eine komplementäre Sequenz; dadurch steigt die Reporter-Fluoreszenz.

Weitere Markierungsverfahren

Neben klassischen Farbstoffen und FRET-Sonden werden auch spezielle Primer- und Sondensysteme eingesetzt. Lux-Primer sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonukleotide. Ihre Fluoreszenzintensität hängt von ihrer chemischen Umgebung ab. Werden diese Primer während einer PCR in DNA eingebaut, kann eine Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden.

Lanthanoid-markierte Sonden tragen am 5'-Ende ein Lanthanoid wie Europium oder Terbium. Sie sind mit einem Oligonukleotid hybridisiert, das am 3'-Ende mit einem Quencher markiert ist.

Ct-Wert, Effizienz und Quantifizierung

Für die Auswertung der qPCR werden verschiedene Rechenmodelle verwendet. Häufig wird ein Referenz-Gen mitgemessen, zum Beispiel GAPDH, Actin oder Tubulin. Dadurch kann ein relativer Mengenvergleich durchgeführt werden, die relative Quantifizierung. Kompliziertere Methoden sollen eine absolute Quantifizierung ermöglichen, also die genaue Anzahl der in der Probe vorhandenen Templates bestimmen.

Der Ct-Wert, englisch cycle threshold, oder Cp-Wert, englisch crossing point, beschreibt den Zyklus, in dem die Fluoreszenz erstmals signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt. Er wird verwendet, weil nur die mittlere Phase der PCR einen exponentiellen und damit quantifizierbaren Anstieg zeigt. In der ersten Phase ist die Templatemenge begrenzt und das Zusammentreffen von Template, Primer und Polymerase nicht optimal. In der dritten Phase hemmen zunehmende Produktmengen wie DNA, Pyrophosphat und Monophosphatnukleotide die Reaktion, Substrate werden verbraucht, Produktfragmente hybridisieren häufiger miteinander, und Polymerasen sowie Nukleotide werden durch Hitze langsam zerstört. Exponentiell bleibt eine PCR bei 12 bis 400 Ausgangskopien für etwa 30 Zyklen, bei 200 bis 3200 für 25 Zyklen und bei 3200 bis 51200 für höchstens 20 Zyklen.

Die Effizienz E kann mit der Steigung m einer Standardkurve berechnet werden: E = 10^(-1/m) − 1. Dafür wird zum Beispiel ein cDNA-Verdünnungsansatz mit 100 %, 10 %, 1 % und 0,1 % verwendet; die Ct-Werte werden zur Erstellung einer Kurve genutzt. Eine Steigung m von −3,32 bedeutet eine Effizienz von 1, also 100 %, und damit eine Verdopplung der Amplifikate pro Zyklus. Eine Steigung von −3,58 entspricht einer Effizienz von 0,9, also 90 %. Die Formel liefert sinnvolle Werte unter 100 % nur für Steigungswerte kleiner als −3,32.

Die absolute Quantifizierung ist aufwändig und ihre Ergebnisse gelten als fragwürdig, deshalb wird sie selten durchgeführt. Unter anderem muss die Effizienz der reversen Transkription bestimmt werden, die zwischen 5 und 95 % liegen kann, etwa mit synthetisierter RNA bekannter Menge.

Relative Auswertung und Vergleichbarkeit

Für die relative Quantifizierung wird eine interne Kontrolle benötigt. Das kann ein Gen-Transkript sein, dessen Signal Unterschiede in der Ausgangsmenge der eingesetzten RNA ausgleicht. Häufig werden dafür Haushaltsgene verwendet. Der Mengenvergleich mit Haushaltsgenen heißt Normierung. Weil die gesamte Analyse auf diesem Signal beruht, ist die Wahl der internen Kontrolle ein wichtiger Teil des Experiments. Eine ideale interne Kontrolle ist leicht zu detektieren, und ihre Expression sollte nicht während des Zellzyklus, zwischen Zelltypen oder als Antwort auf experimentelle Behandlungen wie Stress, Medikamente oder Krankheit schwanken.

Bei der Berechnung mit einer Standardkurve besteht eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung zwischen dem Logarithmus der eingesetzten Menge und dem Ct. Ist die Ausgangsmenge bekannt, kann eine Standardkurve erstellt werden. Mit der Gleichung x = (Ct − b) / m lässt sich für eine unbekannte Probe der Logarithmus der Kopienzahl bestimmen. Zur Normierung wird die Kopienzahl des Targetgens durch die Kopienzahl der internen Referenz geteilt: Gen (normiert) = Kopienzahl Target / Kopienzahl Referenz. Die unterschiedliche Expression zweier Proben wird als Quotient angegeben: Gen (normalisiert) (Gruppe A) / Gen (normalisiert) (Gruppe B) = n-fache Expression Gruppe A zu Gruppe B.

Bei der ΔΔCt-Methode wird die unterschiedliche Expression als n-fache Expression mit dem ΔΔCt-Wert angegeben. Wichtig ist, dass die beiden beteiligten PCR-Reaktionen die gleiche Effizienz haben. Zuerst werden die Ct-Werte von Zielgen und Referenz voneinander abgezogen, das ergibt ΔCt. Danach wird die Differenz zwischen den ΔCt-Werten zweier Gruppen gebildet, zum Beispiel krank/gesund oder mit/ohne Wirkstoff. Der erhaltene ΔΔCt-Wert wird in die Gleichung n-fache Expression (Gruppe A zu Gruppe B) = 2^(−ΔΔCt) eingesetzt.

Neuere Quantifizierungsalgorithmen sollen die Genauigkeit der relativen Quantifizierung verbessern. Dazu gehören Erweiterungen der ΔΔCt-Formel um die Effizienz des jeweiligen PCR-Ansatzes, regressionsanalytische Anpassungen der qPCR-Daten an eine exponentielle Funktion oder in linearisierter Form an eine Gerade sowie Anpassungen an drei- oder mehrparametrige sigmoide Funktionen. Vorteile dieser überwiegend noch nicht marktreifen Methoden sind eine genauere Analyse und geringere Varianz der PCR-Ergebnisse. Bei einigen Methoden wird die Effizienz in jedem einzelnen Probenansatz berücksichtigt und damit eine single tube-Analyse ermöglicht.

Für reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse müssen die Versuchsbedingungen konstant bleiben. Dazu gehören Assay-Qualität, also Primer, Sonden, Polymerase und Puffer, sowie die eingesetzten Geräte. Bei Block-Systemen mit 96- oder 384-Wells ist die Homogenität entscheidend: Assays sollen in jedem Well und auf baugleichen Geräten gleich gut laufen, und diese Homogenität darf sich im zeitlichen Verlauf nicht verändern. Deshalb sollten regelmäßig Kontrollen durchgeführt werden, bei denen ein Assay in vielen Replikaten über den gesamten Block verteilt analysiert wird. Idealerweise ist das Ergebnis überall gleich. Abweichungen können relevante Auswirkungen haben und lassen sich nicht durch teure Wiederholungen ausgleichen, wenn sie konstant wiederholt werden.