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Peptidsynthese
Bereits bei der chemischen Reaktion von zwei verschiedenen unmodifizierten Aminosäuren können vier verschiedene Dipeptide entstehen. ... Chemie, 1963, 663 …
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Grundprinzip der gezielten Herstellung
Peptidsynthese umfasst Verfahren zur Herstellung von Peptiden, einer biochemisch wichtigen Stoffklasse. Ein Peptid besteht aus Aminosäuren, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Eine gezielte Herstellung definierter Peptide ist durch die direkte Kondensation unmodifizierter Aminosäuren nicht möglich: Bei der Reaktion von zwei verschiedenen Aminosäuren können bereits vier verschiedene Dipeptide entstehen.
Deshalb müssen bei der chemischen Synthese bestimmte reaktive Gruppen vorübergehend geschützt werden. Die Aminogruppe der einen Aminosäure und die Carboxygruppe der anderen Aminosäure werden jeweils durch geeignete Schutzgruppen blockiert. Zusätzlich muss die Carboxygruppe aktiviert werden, damit sie mit der Aminogruppe der zweiten Aminosäure eine Peptidbindung bilden kann. Carbonsäuren und Amine reagieren normalerweise lediglich unter Salzbildung; eine kovalente Bindung entsteht dabei nicht.
Die Reaktion muss außerdem unter Bedingungen ablaufen, bei denen keine Racemisierung eintritt. Racemisierung bedeutet die Umwandlung eines enantiomerenreinen Stoffes in ein Gemisch seiner spiegelbildlichen Formen. Das ist wichtig, wenn enantiomerenreine Produkte hergestellt werden sollen. Ribosomal erzeugte Peptide und Proteine bestehen – mit Ausnahme des achiralen Glycins – ausschließlich aus L-Aminosäuren.
Schutzgruppen und Aktivierung
Zum Schutz der Carboxygruppe kann eine Aminosäure beispielsweise in Gegenwart von Schwefelsäure mit Isobuten zum Aminosäure-tert-butylester umgesetzt werden. Bei Asparagin versagt diese Methode; der tert-Butylester kann dort nur durch Umesterung mit Essigsäure-tert-butylester in Anwesenheit starker Säuren erhalten werden.
Die Aminogruppe wird beispielsweise mit Chlorameisensäurebenzylester (Z-Cl oder Cbz-Cl), Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (Fmoc-Cl) oder Di-tert-butyldicarbonat (BOC-Anhydrid) geschützt. Dabei entstehen entsprechende Urethane. Die Schutzgruppen werden nach der Bildung der Peptidbindung wieder entfernt: Der tert-Butylester lässt sich mit Säuren wie Trifluoressigsäure unter Abspaltung von tert-Butanol hydrolysieren, wobei die Carbonsäure zurückgebildet wird. Urethane werden je nach Schutzgruppe mit Chlorwasserstoff/Eisessig, einer Piperidinlösung oder durch Hydrogenolyse gespalten. Dabei wird die Aminofunktion freigesetzt.
Die Carboxygruppe kann unter anderem in ein Carbonsäurechlorid, ein Carbonsäureazid oder einen 4-Nitrophenylester überführt werden. Besonders häufig wird Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) als Kupplungsreagenz verwendet. Ebenfalls gebräuchlich sind Aktivester von N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol oder N-Hydroxysuccinimid (HOSu). Sie werden beispielsweise mit N,N′-Diisopropylcarbodiimid (DIC), 3-Ethyl-1(N,N-dimethyl)aminopropylcarbodiimid (EDCI), HATU, HCTU, TBTU, Oxyma, COMU, TOMBU oder COMBU hergestellt.
Beispiel einer Peptidkupplung
Bei einer Aktivester-Kupplung reagiert eine Aminosäure zunächst durch Addition an das Heterokumulen Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Es entsteht ein Aktivester. Durch Zugabe von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) wird unter Eliminierung von 1,3-Dicyclohexylharnstoff ein noch reaktiverer Aktivester gebildet. Gibt man anschließend ein Amin hinzu, wird HOBt wieder abgespalten und das gewünschte Amid gebildet. Dieses Amid ist bei Peptiden die neue Peptidbindung.
Die direkte Zugabe des Amins zur Carbonsäure würde dagegen keine Peptidkupplung bewirken. Es käme zu einer Säure-Base-Reaktion und zur Bildung eines sehr unreaktiven Ammoniumcarboxylats. Eine thermische Dehydratisierung dieses Ammoniumcarboxylats zum Amid ist praktisch nicht möglich.
Festphasensynthese und Aufarbeitung
Eine besonders wichtige Methode ist die Festphasensynthese nach Merrifield. Dabei wird das wachsende Peptid an eine feste Matrix gebunden und die Aminosäuren werden schrittweise in wiederholten Synthesezyklen angekoppelt. Als Festphase dienen meistens Polystyrol (PS), Polyamid, Polyethylenglykol (PEG) oder PEG-modifiziertes PS.
Nach jedem Synthesezyklus werden nicht gekoppelte Peptide mit Acetanhydrid acetyliert. Dieser als „capping“ bezeichnete Schritt blockiert sie, damit sie in den folgenden Zyklen nicht weiter reagieren. Andernfalls würden sie einen Synthesezyklus auslassen und fehlerhafte Produkte bilden.
Die Produkte werden meist anschließend gereinigt, beispielsweise durch Fällung oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Durch die Verwendung eines weiteren polymerisierbaren Moleküls im letzten Kopplungsschritt können nach einer anschließenden Polymerisation korrekt synthetisierte Peptide von fehlerhaften und acetylierten Kopplungsprodukten abgetrennt werden.
Mit jeder zusätzlich gekoppelten Aminosäure sinkt die Ausbeute. Proteine mit einer Länge von mehr als 70 Aminosäuren werden deshalb oftmals durch Proteinligation aus zwei oder mehreren Peptiden erzeugt.
Alternativen, Grenzen und Nachhaltigkeit
Eine alternative Methode ist die Bailey-Peptid-Synthese. Sie verwendet NCAs als Edukte. Die aktivierte Carboxygruppe wird dabei über die N-Carbonsäureanhydrid-Methode in Form von α-Aminosäure-N-carboxyanhydriden (NCAs oder Leuchs’schen Anhydriden) dargestellt.
Die chemische Peptidsynthese, insbesondere die Festphasensynthese nach Merrifield, ist heute ein Standardverfahren für kurze bis mittellange Peptide. Ihre Ausbeute sinkt jedoch mit zunehmender Kettenlänge. Bereits bei Peptiden mit mehr als 30–50 Aminosäuren steigt die Wahrscheinlichkeit unvollständiger Kupplungen und von Nebenreaktionen erheblich. Dadurch entsteht eine heterogene Produktmischung. Die Reinigung langer Peptide ist technisch anspruchsvoll und erfordert oft mehrstufige chromatographische Verfahren.
Auch die ökologische Belastung ist eine Einschränkung. Häufig werden große Mengen organischer Lösungsmittel wie DMF und DCM sowie potenziell toxische Kupplungsreagenzien wie HBTU oder TBTU eingesetzt. Diese Stoffe sind oft schlecht biologisch abbaubar und müssen aufwendig entsorgt werden. Der E-Faktor, ein Maß für die Umweltbelastung chemischer Prozesse, ist bei herkömmlichen Peptidsynthesen im Vergleich zur biotechnologischen Produktion besonders hoch.
Daher werden enzymatische Ligationsverfahren, beispielsweise mit Sortasen oder Butelasen, rekombinante Expressionssysteme in Mikroorganismen und kombinatorische Verfahren wie das Numaswitch-Verfahren untersucht. Sie sollen unter anderem die effiziente Herstellung disulfidreicher Peptide unter physiologischen Bedingungen ermöglichen.
Verwendung und historische Entwicklung
Synthetische Peptide werden als Inhibitoren oder Substrate von Enzymen eingesetzt. Außerdem dienen sie in der Immunologie als Antigene.
Die erste Peptidsynthese führte Emil Fischer durch. Von 1902 bis 1907 stellte er etwa 100 Peptide her; das längste bestand aus 17 Aminosäuren. Sein Schüler Emil Abderhalden verbesserte die Peptidsynthese später deutlich.
Das erste erzeugte Peptid mit Hormonwirkung war Oxytocin, ein zyklisches Nonapeptid. Es wurde 1954 von Vincent du Vigneaud synthetisiert. 1955 erhielt du Vigneaud dafür den Nobelpreis für Chemie, insbesondere für Arbeiten über die biochemisch bedeutsamen Schwefelverbindungen und die erste Synthese eines Polypeptidhormons. Die ersten Synthesen von Insulin erfolgten von 1963 bis 1966 durch Helmut Zahn, Y. Wang und Panayotis Katsoyannis.
Die erste Festphasensynthese von Peptiden auf festen Polymeren als Substraten wurde 1966 von Bruce Merrifield und Arnold Marglin am Beispiel von Insulin durchgeführt. Mit der Merrifield-Synthese stieg die Ausbeute pro Reaktionszyklus von 90 % auf 99,5 %. Nebenreaktionsprodukte und Edukte konnten durch Waschen einfach entfernt werden, sodass auch längere Peptide mit akzeptabler Ausbeute hergestellt werden konnten. 1984 erhielt Bruce Merrifield den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung der Methodik zur chemischen Synthese auf einer festen Matrix.
