Electrophoretic Mobility Shift Assay

Zweck und Grundprinzip

Der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), auch Band Shift Assay, ist eine Affinitätselektrophorese zum Nachweis von DNA- oder RNA-bindenden Proteinen, zum Beispiel Transkriptionsfaktoren. Er wird zur Untersuchung von Protein-DNA- beziehungsweise Protein-RNA-Interaktionen eingesetzt und ist eine gängige Methode zur Aufklärung von Mechanismen der Genregulation.

Dafür werden Proteine mit einem DNA-Fragment bekannter Sequenz inkubiert; bei RNA-Interaktionen wird entsprechend ein RNA-Fragment verwendet. Die DNA stammt meist aus einem regulatorischen Bereich eines Gens, etwa einem Promotor oder Enhancer. Anschließend wird die Probe in einem Agarose- oder Polyacrylamid-Gel durch ein elektrisches Feld aufgetrennt.

Bandenverschiebung und Auswertung

Ein Komplex aus Protein und DNA wandert im Gel anders als freie DNA. Diese Laufweitenverschiebung heißt Band Shift und hängt von Ladung, Konformation und Größe des Proteinligandenkomplexes ab. DNA-Protein-Komplexe wandern langsamer als ungebundene DNA. Bei unvollständiger Bindung kann daher zusätzlich eine Bande ungebundener DNA sichtbar sein.

Die DNA wird zur Sichtbarmachung markiert, beispielsweise mit einem Radionuklid, Digoxygenin, Biotin oder einer Fluoreszenzmarkierung. Nicht markierte Proteine sind ohne Proteinfärbung, etwa Silberfärbung, nicht sichtbar. Nicht bindende Proteine dienen als Negativkontrolle. Durch Verdünnungsreihen können Affinitäten ermittelt werden. Die Komplexe dissoziieren während der Elektrophorese nicht, weil die Poren des Gels einen Käfig-Effekt ausüben.

Spezifität, Supershift und Varianten

Zur Prüfung der Bindungsspezifität kann nicht markierte DNA in unterschiedlicher Menge als Blockierer oder Kompetitor eingesetzt werden. Mutierte DNA hilft, spezifische Signale herauszufiltern. Punktmutanten in der markierten DNA oder in einem unmarkierten Kompetitor erlauben Rückschlüsse darauf, welche Nukleotide für die Bindung wichtig sind.

Enthält der Ansatz zusätzlich einen Antikörper gegen das bindende Protein, heißt die Methode Supershift Assay. Der DNA-Protein-Antikörper-Komplex wandert langsamer als der DNA-Protein-Komplex und dieser wiederum langsamer als freie DNA. Eine Abwandlung ist der Methylierungs- und Uracil-Interferenzassay: Er untersucht den Einfluss modifizierter Basen auf die DNA-Bindung und ermöglicht Rückschlüsse auf Nukleotide, die an der Protein-DNA-Interaktion beteiligt sind.