Viraler Vektor

Begriff und Grundprinzip

Virale Vektoren sind Viruspartikel, die in der Gentechnik genetisches Material in Zielzellen einschleusen. Zielzellen können sich in einem lebenden Organismus oder in einer Zellkultur befinden. Der durch ein Virus vermittelte Transport von DNA in eine Zelle heißt Transduktion; Zellen mit solcher DNA heißen transduzierte Zellen.

Im Unterschied zu Virus-like particles (VLP) und Virosomen enthalten virale Vektoren eine zu überbringende Nukleinsäure. Diese kann nur vorübergehend abgelesen werden, bis sie abgebaut ist. Sie kann außerdem als Episom, also getrennt neben dem Erbgut, im Zellkern liegen oder dauerhaft in das Genom integriert werden. Natürlich vorkommende virale Vektoren sind beispielsweise Polydnaviridae.

Virale Vektoren werden in der Grundlagenforschung, in der Gentherapie und als Grundlage von Vektor-Impfstoffen verwendet. Die Technik wurde erstmals in den 1970er Jahren eingesetzt und danach weiterentwickelt.

Aufbau, Herstellung und Auswahl

Für einen Vektor wird die gewünschte DNA-Sequenz in das Virusgenom kloniert. Meist werden dabei Bereiche des viralen Genoms ersetzt. Dem Virus fehlen dann etwa regulatorische Sequenzen oder Gene für Enzyme, Kapsid- oder Membranproteine. Es ist dadurch replikationsdefizient beziehungsweise nicht mehr replikationskompetent: Es kann sich nicht selbst vermehren.

Infektiöse Partikel lassen sich trotzdem in einer Verpackungszelllinie herstellen. Diese Zellen liefern die fehlenden Informationen für Proteine und Nukleinsäuren getrennt durch Komplementation. In der Zielzelle fehlen diese Informationen, weshalb sich der Vektor dort nicht vermehren kann. Das erhöht die Sicherheit gegenüber unkontrolliert replikationskompetenten Vektoren. Durch homologe Rekombination in der Verpackungszelllinie können jedoch wieder replikationskompetente Viren entstehen. Deshalb nutzt man mehrfache Deletionen und verteilt genetische Informationen auf zwei Plasmide (Zwei-Plasmid-System) oder auf drei oder mehr Plasmide, die gemeinsam transfiziert werden müssen.

Geeignete Vektoren sollen sicher sein und eine geringe Genotoxizität besitzen, also das Erbgut möglichst wenig schädigen. Weitere Kriterien sind geringe Zytotoxizität und Symptomatik, Stabilität, Zelltypspezifität und ausreichende genetische Verpackungskapazität. Durch Proteindesign lassen sich Eigenschaften des Transgens und des von ihm exprimierten Proteins gezielt anpassen. Präexistierende Antikörper gegen Vektorproteine können den Vektor früh abbauen; deshalb werden gegebenenfalls Vektoren oder Subtypen gewählt, gegen die möglichst keine solchen Antikörper vorhanden sind.

Für die Behandlung von Gendefekten ist eine persistente, also anhaltende Genexpression erwünscht. Transiente Vektoren mit vorübergehender Wirkung werden zur Immunisierung, zur Phagentherapie teilweise antibiotikaresistenter Bakterien, bei onkolytischen Viren gegen Tumoren und zur Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen eingesetzt.

Forschung, Gentherapie und Impfungen

In der Grundlagenforschung wurden virale Vektoren als Alternative zur Transfektion nackter DNA entwickelt. Gegenüber der Calcium-Phosphat-Transfektion kann die Transduktion nahezu 100 % der Zellen mit genetischem Material erreichen, ohne ihre Lebensfähigkeit wesentlich einzuschränken. Manche Vektoren integrieren DNA in das Genom der Zielzelle. Die Genexpression kann dadurch stabil sein und an Tochterzellen weitergegeben werden. Da die Vektorproduktion aufwändig ist, bleiben verbesserte Transfektionstechniken für viele Anwendungen die bessere Lösung.

Mit Vektoren können Gene exprimiert werden, um die Funktion der entsprechenden Proteine zu untersuchen. Retrovirale Vektoren mit stabilen Markergenen wie GFP dienen zur dauerhaften Markierung von Zellen und ihrer Nachkommen, beispielsweise bei Xenotransplantationen. Gene für shRNAs und miRNAs im Vektor werden für RNA-Interferenz-Experimente genutzt.

In der Gentherapie sollen gesunde Gene defekte Gene ersetzen, etwa bei monogenetischen Erbkrankheiten. Studien mit unterschiedlichen Vektoren gibt es seit Beginn der 1990er Jahre. Fortschritte in vitro waren bei Patientinnen und Patienten jedoch weiterhin mit Risiken verbunden; deshalb fand die Gentherapie noch keine breite Anwendung. Immunreaktionen gegen einen Vektor können Komplikationen auslösen, wie beim 1999 mit einem adenoviralen Vektor behandelten Jesse Gelsinger. Retrovirale Vektoren integrieren zufällig, bevorzugen je nach Virustyp aber bestimmte Bereiche: HIV aktive Gene, MLV Promotorregionen. Dabei können Wirtsgene unterbrochen oder stillgelegte Gene aktiviert werden; dies kann zu Tumoren führen. In einer SCID-Studie von 1999 in Frankreich entwickelten vier von 10 behandelten Kindern infolge der Behandlung Leukämien.

Bei Vektor-Impfstoffen trägt ein transienter Vektor eine codierende Sequenz eines Pathogenteils in die Zelle, wo sie exprimiert wird. Zugelassen sind cAd3-ZEBOV, VSV-EBOV, AZD1222, Ad26.COV2.S und Sputnik V; sie beruhen auf Adenoviren oder VSV. Nach der ersten Anwendung kann Vektorimmunität entstehen: Antikörper gegen Vektorproteine bauen den Vektor bei einer erneuten Gabe möglicherweise vor seiner Wirkung ab. Prime-Boost-Ansätze verwenden deshalb unterschiedliche Vektoren mit denselben Transgenen.

Retrovirale und lentivirale Vektoren

Retroviren sind weit verbreitete persistente Vektoren und stehen im Zentrum der gentherapeutischen Forschung. Rekombinante Retroviren können stabil in das Wirtsgenom integrieren und sind laut Artikel das derzeit einzige Instrument, um monogenetische Erbkrankheiten dauerhaft zu heilen. Bis 2007 wurden knapp 300 klinische Studien mit retroviralen Vektoren durchgeführt.

Einfache Retroviren wie das gammaretrovirale Murine Leukämievirus benötigen die Auflösung des Zellkerns während der Mitose. Sie können daher ruhende Zellen, beispielsweise Nervenzellen, nicht transduzieren. Gammaretrovirale Vektoren können über starke U3-Enhancer in ihren LTRs potenzielle Onkogene nahe dem Integrationsort aktivieren. SIN-Vektoren (self inactivating) besitzen diese Enhancer nicht im 3'-LTR-Bereich; nach reverser Transkription und Integration fehlen sie auch im 5'-LTR-Bereich. Das senkt das Risiko der Protoonkogenaktivierung, verhindert es aber nicht vollständig. Durch Pseudotypisierung, etwa mit VSV-G, lässt sich der Tropismus, also die bevorzugte Zielzellart, verändern.

Lentiviren sind eine Gattung der Retroviren und können im Gegensatz zu Gammaretroviren auch ruhende Zellen replizieren. Ihre komplexere Biologie erschwert die Vektorentwicklung. Nach einer im November 2006 veröffentlichten klinischen Studie zur Unterdrückung der HIV-1-Replikation bei Aids wurde eine positive Bilanz gezogen. Auch für Lentiviren gibt es sicherere SIN-Vektoren.

Foamyviren sind eine zoonotische Unterfamilie der Retroviren. Ihr großes Genom kann größere therapeutische Gene verpacken, und ihre allgemeine Apathogenität gilt als Vorteil. Sie bevorzugen bei der Integration weniger als MLV oder HIV aktive Gene und Transkriptionsstartstellen und bilden keine für die Gentherapie unbrauchbaren VLP. Ein Problem ist die mangelnde Pseudotypisierbarkeit; auch hier werden SIN-Vektoren eingesetzt.

Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren

Adenoviren integrieren nicht in das Zellgenom. Ihre DNA gelangt in den Zellkern, wird bei Zellteilungen aber nicht repliziert und liegt episomal vor. Adenovirusvektoren sind damit nichtintegrierend und nichtreplizierend. Sie infizieren menschliche Zellen leicht, verursachen beim Menschen wenig Symptome, lösen aber eine starke Immunreaktion aus. Sie eignen sich deshalb besonders für Immunisierungen oder für Gentherapie mit nur vorübergehender Zielgenexpression, etwa bei cAd3-ZEBOV und bei onkolytischen Viren gegen Tumoren. Vektoren der dritten Generation benötigen für die Virionproduktion Kofaktoren in einer Verpackungszelllinie.

Adenovirusvektoren können Vektorimmunität auslösen; ein Serotyp kann daher pro Patient nur einmal eingesetzt werden. Bei Sputnik V exprimieren die rekombinanten humanen Adenoviren Typ 26 (rAd26-S) und Typ 5 (rAd5-S) das Spikeprotein von SARS-CoV-2. Die beiden Typen werden zeitlich versetzt als Prime/Boost gegeben, um Vektorimmunität zu umgehen. Weitere adenovirale Impfstoffe sind AZD1222 und Ad26.COV2.S.

Adeno-assoziierte Viren (AAV) verursachen beim Menschen asymptomatische Koinfektionen während einer adenoviralen Infektion und werden für persistente Vektoren genutzt. In Virionen passen höchstens acht Kilobasen einzelsträngige DNA. Bei selbst-komplementärer DNA beträgt die maximale Länge eines Transgens fünf Kilobasen; darüber sinkt der Virustiter. Auch hier begrenzen Antikörper gegen Kapsidproteine die wiederholte Anwendung eines Serotyps. AAV-Vektoren wurden jedoch in transkriptionsaktiven Genombereichen integriert gefunden, was zur Tumorentstehung beitragen kann. Eladocagen exuparvovec ist ein zugelassener AAV2-Vektor.

Weitere Vektortypen

Das Vesicular stomatitis virus (VSV) verursacht beim Menschen wenige Symptome und wird als transienter, aber replikationskompetenter Impfvektor verwendet, beispielsweise bei VSV-EBOV. Das Newcastle-Disease-Virus dient als transienter Impfvektor und als onkolytisches Virus.

Modified Vaccinia Ankara (MVA) ist ein attenuiertes Pockenvirus. Es wird nach dem Hinzufügen weiterer Antigene als transienter Vektor gegen andere Krankheiten genutzt. Wegen Vektorimmunität wirkt MVA nur bei Impflingen, die zuvor keine Pockenimpfung erhalten hatten.

Alphavirus-Replikons sind transiente, im Zytosol replikationskompetente Vektoren aus nicht-humanpathogenen Alphavirus-Stämmen. Ihre RNA kann auch ohne Virushülle oder Kapsid transfiziert werden. Die Replikation verlängert die Wirkung, doch der zytopathische Effekt beendet sie langsam.

Baculovirale Vektoren werden in Insektenzellkulturen unter anderem für die Produktion von AAV-Vektoren eingesetzt. Insektenzellen ermöglichen bei transienten Viren eine kontinuierliche Kultur, verringern das Risiko einer Kontamination mit humanpathogenen Viren und wachsen bei Raumtemperatur ohne CO₂-Begasung. Ihre Protein-Glykosylierungsmuster können jedoch abweichen. Es existieren auch Baculovirusvektoren für Säugerzellen.