Vektordesign

Aufgabe und Aufbau von Vektoren

Vektordesign ist in der Gentechnik die gezielte Anpassung eines Vektors mit molekularbiologischen Methoden, um DNA zu vervielfältigen. Ein frühes Beispiel ist das 1977 aus einem natürlich vorkommenden Plasmid entwickelte Plasmid pBR322. Plasmide wurden anschließend verkleinert sowie mit neuen Antibiotikaresistenzen und Replikationsursprüngen ausgestattet.

Besonders häufig wird die Klonierungsstelle verändert. Sie enthält oft eine multiple Klonierungsstelle (mcs, multiple cloning site), auch Polylinker genannt: einen Bereich mit vielen Restriktionsenzym-Erkennungsstellen, die jeweils nur einmal im Plasmid vorkommen. Dort kann Fremd-DNA gezielt eingebaut und anschließend amplifiziert, also vervielfältigt, werden.

Für die Herstellung rekombinanter Proteine sowie codierender oder nichtcodierender Ribonukleinsäuren werden passende flankierende Regulationsstellen eingefügt. Solche Vektoren können transient, also vorübergehend, eingesetzt werden, etwa bei transienten viralen Vektoren, DNA-Impfstoffen, transienter Transfektion oder onkolytischen Viren. Permanente Anwendungen sind beispielsweise Gentherapie und die Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen.

Herstellungsorganismus oder -zelltyp und Zielorganismus müssen nicht gleich sein. Solche Pendelvektoren (shuttle vectors) werden an beide Wirte angepasst, zum Beispiel Plasmide mit eukaryotischen Expressionskassetten oder virale Vektoren, die in Zellkulturen verpackt werden.

Steuerung von Expression und Replikation

Um die Genexpression zu steigern, werden auch DNA-Abschnitte außerhalb der proteincodierenden Sequenz verändert. Promotor, Enhancer und Terminator können die Expressionsmenge erhöhen, wenn sie in der jeweiligen Spezies funktionieren. Dabei bestehen deutliche Unterschiede zwischen Säugern, Bakterien und Archaeen. Das Design richtet sich außerdem danach, ob der Vektor als Klonierungsvektor oder als Expressionsvektor dienen soll.

Bei Eukaryoten können Kernexportsequenzen die RNA-Konzentration im Zytosol erhöhen und damit die Proteinbildung am Ribosom steigern. Eine Kozak-Sequenz verbessert die Erkennung der mRNA am Ribosom. Ein Polyadenylierungssignal und das Vermeiden von AUUUA-Sequenzen am 3'-Ende vermindern den vorzeitigen Abbau der mRNA.

Der Polylinker ist modular: Durch Einfügen oder Entfernen einer Restriktionsenzym-Erkennungssequenz kann er verändert werden. Austauschbare Expressionskassetten erlauben einen Austausch durch homologe Rekombination oder das RMCE-Kassettenaustauschverfahren. Sollen mehrere Proteine gebildet werden, können mehrere Vektoren, mehrere Operons in einem Vektor, IRES, Inteine oder 2A-Peptide genutzt werden.

Ein oder mehrere Replikationsursprünge und gegebenenfalls notwendige Centromere können die Replikation eines Plasmidvektors erweitern. Dadurch ist etwa bei Plasmiden in Säugerzellen eine längerfristige Expression möglich. Parallel zum Vektordesign wird oft die proteincodierende Sequenz verändert. Eine Codon-Optimierung der Expressionskassette kann dabei die Expressionsrate steigern oder andere Eigenschaften verändern.

Sicherheitsmaßnahmen

Eine zentrale Anforderung ist die Sicherheit des Vektors bei der Anwendung in Lebewesen. Bezogen auf den Menschen wird sie durch die biologische Schutzstufe beschrieben. Diese berücksichtigt die Pathogenität. Sie hängt unter anderem davon ab, ob sich der Vektor replizieren kann, ob er das Genom dauerhaft verändern kann, wie infektiös er ist und welche Symptome auftreten. Eine Insertion in das Genom kann eine Tumorentstehung begünstigen.

Bei bakteriell hergestellten Vektoren werden herstellungsbedingte Pyrogene untersucht, um eine überschießende Immunreaktion zu vermeiden. Außerdem dürfen Resistenzgene, die bei der Herstellung von Plasmiden zur Selektion genutzt werden, nicht auf Mikroorganismen wie Haut-, Mund- oder Darmflora übertragen werden. Als Alternative werden Auxotrophien zur Selektion transgener Organismen verwendet oder Resistenzgene nachträglich entfernt.

Bei viralen Vektoren werden Gene gelöscht, die für die Replikation notwendig sind. Die Herstellung gelingt dann nur durch Komplementation in einer Zelllinie, die diese Gene vorher erhalten hat; dies heißt Replikationsdefizienz. Durch Pseudotypisierung kann zudem der Rezeptor und damit der Tropismus, also die Zielzellbindung, eingeschränkt oder verändert werden. Zelltyp-spezifische Promotoren können die Genexpression örtlich begrenzen.

Vor gentechnischen Methoden wurde die Sicherheit von Viren durch Attenuierung erhöht. Beispiele für solche Lebendimpfstoffe sind die Schluckimpfung gegen Poliomyelitis sowie die auf dem Vacciniavirus beruhenden Pockenimpfstoffe MVA und NYVAC.