Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Grundidee und Aufbau

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist ein analytisches Verfahren der Chemie. Sie trennt die Bestandteile eines Stoffgemisches und ermöglicht, diese mithilfe bekannter Standards zu identifizieren und zu quantifizieren, also ihre Konzentration zu bestimmen. Anders als die Gaschromatographie eignet sie sich auch für nicht flüchtige Substanzen. Neben der analytischen Untersuchung kann die HPLC präparativ zur Reinigung und Gewinnung von Stoffen eingesetzt werden.

Die Probe wird zusammen mit einem flüssigen Laufmittel durch eine Trennsäule gepumpt. Das Laufmittel heißt mobile Phase, Eluent oder Elutionsmittel. In der Säule befindet sich die stationäre Phase, ein Material, mit dem die einzelnen Bestandteile der Probe unterschiedlich stark wechselwirken. Stark wechselwirkende Bestandteile bleiben länger in der Säule; schwach wechselwirkende verlassen sie früher. Die Zeit bis zum Austritt heißt Retentionszeit. Am Säulenende weist ein Detektor die getrennten Stoffe nach. Das Trennvermögen der HPLC ist etwa 100-mal größer als das der Säulenchromatographie.

Analytische Trennsäulen sind 18 bis 300 mm lang und besitzen meist einen Innendurchmesser von 2 bis 4,6 mm. Eine vorgeschaltete Vorsäule oder ein Säulenfilter aus dem gleichen Material kann Verunreinigungen zurückhalten und dadurch die Hauptsäule schützen. Präparative Laborsäulen haben beispielsweise 10 oder 25 mm Durchmesser; im industriellen Maßstab können Säulen bis zu einem Meter Durchmesser eingesetzt werden.

Zu einer typischen Anlage gehören Eluentenreservoirs, Mischventile und Pumpe, Einspritzventil, Mischkammer, Trennsäule, Detektor sowie ein Computer zur Verarbeitung und Ausgabe der Ergebnisse. Eine Druckkompensationsschleife kann die Pumpimpulse ausgleichen.

Trennprinzipien und mobile Phasen

Nach dem Trennprinzip unterscheidet man Normalphasen-, Umkehrphasen-, Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatografie sowie die Enantiomerentrennung. Enantiomere sind spiegelbildliche Molekülformen, die einander sehr ähnlich sind.

Bei der Normalphasen-HPLC (NP-HPLC) ist die stationäre Phase polar, beispielsweise Silicagel beziehungsweise Kieselgel. Polare Moleküle werden stärker adsorbiert oder retardiert, also zurückgehalten, und verlassen die Säule später als unpolare Moleküle. Die Elutionskraft der mobilen Phase hängt im Allgemeinen von ihrer Polarität ab: Je polarer die mobile Phase ist, desto schneller wird ein Stoff eluiert, also aus der Säule herausgelöst. Lösungsmittel lassen sich nach zunehmender Polarität in einer elutropen Reihe anordnen. Ein Nachteil ist, dass meistens organische Lösungsmittel und keine wässrigen Eluenten verwendet werden können.

Eine Alternative ist die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC). Sie verwendet wie die Normalphasen-HPLC polare stationäre Phasen, funktioniert aber mit wässrigen Puffersystemen als Eluent. Anders als bei der Umkehrphasenchromatographie ist Wasser in der HILIC das stärkste Elutionsmittel.

Die Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) ist die häufigste Form; etwa 70 % aller analytischen HPLC-Trennungen sind RP-Trennungen. Sie arbeitet mit einer unpolaren stationären Phase. Dafür lässt man mit langkettigen Kohlenwasserstoffen substituierte Silane mit Silicagel reagieren. Die polare Oberfläche der Silicagel-Partikel erhält dadurch eine unpolare Alkanschicht. Als mobile Phase dienen meist Mischungen aus Wasser oder Puffer und Acetonitril oder Methanol. Anders als bei der Normalphase sinkt die Elutionskraft mit steigender Polarität der mobilen Phase.

Besonders häufig wird eine C18- oder ODS-Säule verwendet, bei der Octadecylsilan zur Veränderung des Silicagels dient. Die RP-HPLC eignet sich unter anderem für polare Analyten, deren Retentionszeiten auf einer Normalphase zu hoch wären. Ihre Retentionszeit hängt von der Verweildauer in der stationären Phase ab; geschwindigkeitsbestimmend ist die Desorption, also die Zurücklösung in die mobile Phase.

Bei einer isokratischen Trennung bleibt die Zusammensetzung der mobilen Phase während der gesamten Analyse gleich. Bei einer Gradiententrennung verändert man während der Analyse die Polarität des Fließmittelgemisches.

Nachweis, Identifizierung und Quantifizierung

Das Ergebnis einer Trennung wird als Chromatogramm dargestellt. Die Signale der einzelnen Bestandteile erscheinen darin als Spitzen, englisch Peaks. Zur Identifizierung kann man die Retentionszeit einer unbekannten Substanz mit derjenigen eines bekannten Standards vergleichen; dies wird als externe Standardisierung bezeichnet. Eine gleiche Retentionszeit beweist jedoch noch nicht, dass beide Stoffe identisch sind.

Bei der internen Standardisierung setzt man der Probe etwas von der bekannten Substanz zu. Anschließend wird geprüft, ob weiterhin nur ein Peak erscheint, ob ein Doppel-Peak entsteht oder ob zwei getrennte Peaks mit sehr ähnlichen Retentionszeiten sichtbar werden. Auch ein einzelner Peak nach dem Zusatz reicht nicht als sicherer Identitätsnachweis aus. Zusätzliche Hinweise liefern der Vergleich des UV-Spektrums mit einem Diodenarraydetektor oder der Massenspur eines gekoppelten Massenspektrometers. Bei Isomeren sind Retentionszeit, UV-Spektrum und Massenspektrum allerdings häufig keine ausreichenden Identifikationsmerkmale. Die HPLC erleichtert dann vor allem den Ausschluss anderer Möglichkeiten. Mehr Sicherheit kann eine Untersuchung unter zwei unterschiedlichen Trennbedingungen bieten, beispielsweise mit zwei verschiedenen Säulen.

Zur Konzentrationsbestimmung stellt man Standards mit bekannten Konzentrationen her und vergleicht ihre Peak-Flächen mit den Peak-Flächen der Probe. So lässt sich beispielsweise Vitamin E in einem pflanzlichen Öl bestimmen. Falls die Probe zuvor aufgearbeitet wurde, muss die Wiederfindungsrate berücksichtigt werden, also der Anteil des Stoffes, der nach der Aufarbeitung tatsächlich wieder gemessen wird.

HPLC-Trennungen dienen auch präparativen Zwecken. Im Labor und in der chemischen Industrie lassen sich damit Produkte wie Proteine reinigen oder sehr ähnliche Stoffe wie Enantiomere voneinander trennen.

Methodenentwicklung

Die Qualität einer Trennung hängt von zahlreichen Parametern ab: von der Art der Substanzen, der Art und den Maßen der Trennsäule, der Zusammensetzung der mobilen Phase, der Temperatur, dem pH-Wert und der Durchflussgeschwindigkeit der mobilen Phase.

Für komplexere Stoffgemische muss meist eine eigene Methode entwickelt werden, besonders bei Gradiententrennungen. Bereits geringe Abweichungen können die Selektivität verändern, also die Fähigkeit des Systems, bestimmte Stoffe unterschiedlich stark zurückzuhalten. Ziel ist ein reproduzierbares Chromatogramm, in dem alle Peaks vollständig getrennt sind, aber möglichst dicht aufeinanderfolgen. Dadurch bleibt die Dauer des Trennvorgangs gering.

Damit geeignete Einstellungen nicht ausschließlich durch zeit- und kostenaufwendiges Ausprobieren ermittelt werden müssen, verwenden die chemische, pharmazeutische und die Nahrungsmittelindustrie häufig Simulationssoftware. Diese kann auf Grundlage experimenteller Daten oder der Molekülstrukturen der Proben geeignete Methoden vorhersagen.

UHPLC und kontinuierliche Trennung

Die Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) ist eine besonders leistungsfähige Form der HPLC. Sie wurde entwickelt, um den Probendurchsatz zu erhöhen und zugleich kleinere Probenvolumina zu verwenden. Hersteller verwenden dafür auch Bezeichnungen wie RRLC, RSLC, UFLC, UPLC und ULDC.

Gemeinsam ist diesen Techniken ein Säulenmaterial mit Partikeldurchmessern von 2,2 bis 1,7 μm. Die kleinen Partikel steigern Geschwindigkeit und Effizienz der Trennung. Eine typische UHPLC-Analyse einschließlich Gradientenelution und anschließender Equilibrierung dauert 5 bis 10 Minuten, nach einer Faustregel etwa ein Zehntel so lange wie eine HPLC-Analyse. Übliche Probenvolumina betragen 0,5 bis 2 µl. Etablierte Verfahren können sogar Analysezeiten von weniger als einer Minute erreichen.

Dafür sind Arbeitsdrücke von bis zu 1000 Bar erforderlich. Säulen, Probengeber, Pumpen, Ventile und Verbindungselemente müssen diesem Druck zuverlässig standhalten. Bauteile klassischer HPLC-Anlagen können dabei beschädigt werden; eine Anlage schaltet deshalb beim Auftreten eines zu hohen Drucks, etwa infolge einer verstopften Säule, programmiert ab. Zusätzlich verkürzen schnelle und verschleppungsarme Probengeber, kleinere Kapillaren, empfindliche Detektoren und eine geringe Gradientenverzögerung die Analysezeit.

Die erste UHPLC-Anlage brachte die Waters Corporation 2004 unter dem Namen UPLC™ auf den Markt. UHPLC ist inzwischen eine Standardmethode und löst die klassische HPLC in vielen Bereichen ab. Dazu tragen ihre zunehmende Verbreitung und der einfache Methodentransfer bei.

Die Simulated-moving-bed-Technologie (SMB) ist ein weiteres hocheffektives Trenn- und Reinigungsverfahren, besonders für die Naturstoff- oder Arzneistoffanalytik. Sie arbeitet nach dem Prinzip der kontinuierlichen Gegenstromverteilung.

Detektoren

Detektoren erfassen die Stoffe, nachdem sie die Trennsäule verlassen haben. Verwendet werden UV/VIS-Detektoren, Diodenarraydetektoren (DAD), Multiwellenlängendetektoren (MWD), Lichtstreu-, Fluoreszenz-, Brechungsindex-, Leitfähigkeits- und Radioaktivitätsdetektoren. Hinzu kommen elektrochemische Detektoren mit Amperometrie oder Coulometrie sowie stickstoffselektive Detektoren.

Häufig erfolgt die Detektion mit UV- oder Fluoreszenzdetektoren. Zunehmend wird die HPLC mit einfachen Massenspektrometern (MS) oder Tandem-Massenspektrometern gekoppelt. Die Wahl des Detektors richtet sich danach, welche Eigenschaften die zu untersuchenden Stoffe besitzen und welche Informationen für Nachweis oder Identifizierung benötigt werden.