Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Grundprinzip und Messung

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist ein antikörperbasiertes Nachweisverfahren. Er gehört wie der Radioimmunassay (RIA) zu den Immunassays, verwendet jedoch keine Radioaktivitätsmessung, sondern eine enzymatische Farbreaktion. Nachgewiesen werden können Proteine, etwa Antikörper, Viren sowie niedermolekulare Stoffe wie Hormone, Toxine und Pestizide in Proben wie Blutserum, Milch oder Urin.

Das Verfahren nutzt die spezifische Bindung eines Antikörpers an ein Antigen, also an den nachzuweisenden Stoff. Ein Antikörper ist mit einem Reporterenzym verbunden. Dieses setzt ein Substrat, auch Chromogen genannt, in ein gefärbtes Reaktionsprodukt um. Der Farbumschlag oder teilweise eine Chemolumineszenz zeigt an, dass das Antigen vorhanden ist. Die Signalstärke hängt von der Antigenkonzentration ab und kann mit einem Photometer als optische Extinktion beziehungsweise optische Dichte (OD) gemessen werden. Durch den Vergleich mit einer Standardreihe bekannter Konzentrationen ist auch eine quantitative Bestimmung möglich.

Häufig verwendete Reporterenzyme sind Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase (AP) und seltener Glucose-Oxidase (GOD). Bei AP kann p-Nitrophenylphosphat (pNPP) als Substrat verwendet werden. Das Enzym spaltet den Phosphatrest ab; es entsteht das schwach gelbe p-Nitrophenol. Bei Peroxidase wird häufig o-Phenylendiamin (oPD) eingesetzt. Die Konzentrationsänderung des Farbstoffs kann nach dem Lambert-Beerschen Gesetz photometrisch verfolgt werden.

Signalverstärkung

Zur Signalverstärkung kann statt eines direkt enzymgekoppelten Detektionsantikörpers ein ungekoppelter Detektionsantikörper zusammen mit einem zusätzlichen, enzymgekoppelten sekundären Antikörper verwendet werden. Dieser sekundäre Antikörper bindet als Antikörper gegen Antikörper an den ersten Antikörper. Das Verfahren benötigt einen weiteren Inkubations- und Waschschritt; als Puffer wird meistens TBS-T verwendet.

Der Vorteil liegt darin, dass nicht für jedes Antigen ein eigener enzymgekoppelter Primärantikörper hergestellt werden muss. Sekundäre, häufig polyklonale Antikörper können an verschiedene Epitope der konstanten Fc-Region von Antikörpern einer Spezies binden. Sie sind dadurch vielseitig einsetzbar, verstärken das Signal und können als kostengünstige Produkte für viele Immunassays verwendet werden. Eine weitere Signalverstärkung entsteht durch Streptavidin- oder Avidin-Enzym-Konjugate, die an biotinylierte Detektionsantikörper binden. Mehrere Biotinylierungen ermöglichen die Bindung mehrerer Reportermoleküle.

Fluoreszenz- oder Polymerase-Kettenreaktions-basierte Systeme, etwa Immuno-PCR, können höhere Sensitivitäten oder parallele Bestimmungen (Multiplex) ermöglichen. Im strengeren Sinne gelten sie jedoch nicht als ELISA.

ELISA-Varianten

Beim Antikörper-ELISA wird das Antigen ohne sogenannten Coating- oder Capture-Antikörper direkt an die Polystyroloberfläche einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Anschließend werden Antikörperkonzentrationen im Vergleich mit einer Standardreihe bestimmt.

Der Sandwich-ELISA verwendet zwei Antikörper, die beide spezifisch an das Antigen binden. Sie müssen an unterschiedlichen Stellen, den Epitopen, ansetzen, damit sie sich nicht gegenseitig behindern. Der erste Antikörper wird als Coat- oder Capture-Antikörper an die feste Phase gebunden, meist an den Boden einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Wells). Die Probe wird hinzugegeben und inkubiert. Danach entfernt ein Waschschritt ungebundene Bestandteile. Ein zweiter, zunächst unmarkierter Detektionsantikörper bindet an ein weiteres Epitop des Antigens. Nach erneutem Waschen wird ein markierter sekundärer Antikörper hinzugefügt, der an den Detektionsantikörper bindet und die Farbreaktion ermöglicht. Eine Standardreihe bekannter Antigenkonzentrationen liefert eine Kalibrierungskurve für die gemessene optische Extinktion oder emittierte Intensität.

Beim kompetitiven Immunassay wird kein zweiter markierter Antikörper eingesetzt. Stattdessen konkurriert ein markiertes Kompetitor-Antigen, eine dem Analyten strukturell ähnliche synthetische Verbindung, mit dem Analyt um Bindungsstellen am Antikörper. Das Signal ist umgekehrt proportional zur Analytkonzentration: Wenig Analyt führt zu einer starken Farbreaktion, viel Analyt zu einer schwachen. Enzyme und Substrate entsprechen meist denen des ELISA.

Logit-Log-Plot und Auswertung

Trägt man den Logarithmus der Konzentration gegen die Extinktion auf, entsteht häufig eine sigmoide Kurve. Für eine lineare Regression wird sie durch Normalisierung und die Logit-Funktion linearisiert. Mit der unteren Asymptote u, der oberen Asymptote o und dem Messwert w gilt:

n = (w − u) / (o − u)

Die Umkehrfunktion lautet:

w = u + n · (o − u)

Der Logit-Wert L wird berechnet durch:

L = ln(n / (1 − n))

Umgekehrt gilt:

n = e^L / (1 + e^L)

Im Logit-Log-Plot ist x der natürliche Logarithmus der Konzentration und y der Logit-Wert. Die lineare Regression ergibt:

y = a + b · x

Für die Rückrechnung gilt:

x = (y − a) / b

Die höchste Präzision liegt nahe dem Wendepunkt der Sigmoide, weil dort die Steigung am größten ist; nahe den Asymptoten ist die Genauigkeit am geringsten. Der Wendepunkt entspricht n = 0,5 beziehungsweise L = 0. Für unbekannte Proben werden die Umkehrfunktionen zur Interpolation verwendet. Statt ln sind auch dekadische oder logarithmische Werte zur Basis 2 zulässig. Ebenso kann die Verdünnung anstelle ihres Kehrwertes verwendet werden. Nicht zulässig ist jedoch, den Logit unmittelbar aus den nicht normalisierten Extinktionswerten w zu berechnen.