DNA-Reparatur

Aufgabe und Bedeutung der DNA-Reparatur

DNA-Reparatur bezeichnet Mechanismen, mit denen Zellen Schäden an der Desoxyribonukleinsäure (DNA) beseitigen. Schäden können spontan bei der DNA-Replikation entstehen oder durch mutagene Stoffe, extreme Wärme und ionisierende Strahlung verursacht werden. Ohne erfolgreiche Reparatur kann die DNA bei der Mitose falsch repliziert werden, Proteine können fehlen oder falsch gebildet werden, und nach Doppelstrangbrüchen können Chromosomenbereiche abgespalten werden.

Sammeln sich Fehler in wachsenden oder ruhenden somatischen Zellen an, werden normale Zellfunktionen gestört. Bei Keimzellen können Tochterzellen nicht mehr lebensfähig sein; die Zelllinie verliert dann in der zweiten oder dritten folgenden Generation ihre Teilungsfähigkeit und stirbt. Kontrollproteine der Zellzykluskontrolle können defekte DNA erkennen und einen Zyklusarrest in der G0-Phase (Zellseneszenz) oder programmierten Zelltod (Apoptose) auslösen. Nicht reparierte Schäden in Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen können Krebs verursachen.

Für verschiedene Schäden gibt es spezialisierte Wege. Einige reparieren Einzelstrangschäden, andere Doppelstrangbrüche. Prokaryonten und Eukaryonten unterscheiden sich dabei unter anderem durch ihre DNA-Polymerasen. In E. coli dauert eine Basenexzisionsreparatur nach Messungen mit PAL-Mikroskopie gut zwei Sekunden. Tomas Lindahl, Paul Modrich und Aziz Sancar erhielten 2015 für Arbeiten zur DNA-Reparatur den Nobelpreis für Chemie.

Ursachen und Formen von DNA-Schäden

Schäden können durch Stoffwechselvorgänge, chemische Substanzen und ionisierende Strahlung entstehen, beispielsweise durch UV-Strahlung, Elektronen oder Protonen. Auch Fehler bei der Replikation und bei anderen zellulären Prozessen können Mutationen verursachen. Mutationen besitzen eigene Reparaturmechanismen und können daher ähnlich wie DNA-Schäden betrachtet werden.

Beim normalen Metabolismus entstehen reaktive Sauerstoffspezies (ROS), darunter Sauerstoffradikale. Sie verursachen vor allem oxidative Basenschäden und Einzelstrangbrüche; weniger als 0,5 % der Schäden sind Doppelstrangbrüche. Endogen verursachte Schadenscluster, also gehäufte und schwer zu reparierende Läsionen, sind sehr unwahrscheinlich. Eine hohe Protonendichte oder Temperatur kann Depurinierungen oder Depyrimidierung auslösen.

Zu den Schadensarten gehören Basenmodifikationen: Pyrimidindimere, meist 6–4-Photoprodukte (6-4PPs) oder Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPDs), oxidierte Basen wie 8-Oxo-7,8-Dihydroguanin (8-oxoG) und 8-Oxo-7,8-Dihydroadenin (8-oxoA), alkylierte Basen sowie sperrige Basenveränderungen („bulky lesions“). Weitere Schäden sind Basenfehlpaarungen (Mismatch), Basenverlust als AP-Stellen, Veränderungen des Zuckergerüsts, DNA-Protein- und DNA-DNA-Vernetzungen, Einzelstrangbrüche und Doppelstrangbrüche.

Eine Behandlung mit einem Gray Röntgenstrahlung erzeugt pro Zelle etwa 1000–2000 Basenmodifikationen, 500–1000 Einzelstrangbrüche, 800–1600 Veränderungen des Zuckergerüsts, 150 DNA-Protein-Vernetzungen und 50 Doppelstrangbrüche.

Reparatur einzelner Basen und Fehlpaarungen

Die Basenexzisionsreparatur (BER, base excision repair) behebt oxidierte, alkylierte oder desaminierte einzelne Basen. Eine jeweils passende DNA-Glykosylase erkennt die beschädigte Base, wandert an der kleinen Furche entlang und klappt die Base in ihr katalytisches Zentrum. Sie entfernt die Base. Danach setzt eine AP-Endonuklease einen Einzelstrangbruch in das Zucker-Phosphat-Rückgrat. Eine DNA-Polymerase ergänzt anhand der komplementären Base des unbeschädigten Strangs die richtige Base; anschließend verbindet eine DNA-Ligase den Strang. Beim short patch repair wird eine Base ersetzt, beim long patch repair 2–20 Nukleotide. Beim Menschen ist DNA-Polymerase β (Pol β) die wichtigste Polymerase.

Die Nukleotidexzisionsreparatur (NER, nucleotide excision repair) erkennt vor allem „bulky lesions“, die einen Buckel bilden und die DNA-Helix stören. Dazu zählen durch UV-Strahlung erzeugte Pyrimidindimere und 6,4-Photoprodukte. NER umfasst Schadenserkennung, Einschneiden, das Entfernen eines 25–30 Basen langen Abschnitts, dessen Neusynthese und die Ligation. In E. coli wirken Uvr-Proteine und DNA-Polymerase I mit. Bei Eukaryonten sind unter anderem Proteine beteiligt, die nach Xeroderma pigmentosum und Cockayne-Syndrom benannt sind, etwa XPA und CSA, sowie DNA-Polymerasen δ, ε und/oder κ. Global Genome Repair (GGR) repariert Schäden in transkriptionsinaktiver DNA; Transcription Coupled Repair (TCR) repariert Schäden in gerade transkribierter DNA. Beide unterscheiden sich nur bei der Schadenserkennung.

Beim Korrekturlesen während der Replikation kann eine DNA-abhängige DNA-Polymerase Fehlpaarungen erkennen, entfernen und das richtig gepaarte Desoxyribonukleotid einsetzen. Mismatch-Reparaturproteine senken die Fehlerquote zusätzlich; die Zahl spontaner Mutationen liegt dadurch etwa um das Tausendfache niedriger. Der zunächst noch nicht methylierte Tochterstrang kann über seinen Methylierungsstatus von der Elternstrangmatrize unterschieden werden. Defekte der Mismatchreparatur können ein hereditäres non-polypöses kolorektales Karzinom verursachen.

Direkte Lichtreparatur

Bei der Photoreaktivierung lösen Photolyasen Cyclobutan-Ringe und (6-4)-Photoprodukte auf, die durch ultraviolette Strahlung entstanden sind. Über einen Antennenkomplex absorbieren sie blaues oder ultraviolettes Licht. Mit dieser Energie überträgt ihr Kofaktor FAD zwei Elektronen auf den im aktiven Zentrum gebundenen DNA-Schaden, der daraufhin gespalten wird. Die ursprüngliche DNA-Struktur wird damit wiederhergestellt, ohne dass Basen herausgeschnitten oder eingefügt werden.

Photolyasen wurden in vielen Organismen nachgewiesen, von Prokaryoten über Pilze und Pflanzen bis zu Beuteltieren. Im Lauf der Evolution gingen sie mehrfach verloren. Höhere Säugetiere, einschließlich des Menschen, besitzen keine reparaturaktiven Varianten mehr; die Gründe sind nicht abschließend geklärt.

Reparatur von Doppelstrangbrüchen

Doppelstrangbrüche werden entweder homolog oder nicht-homolog repariert. Nicht-homologe Reparatur ist fehleranfälliger und führt oft zu kleinen Deletionen oder Insertionen. Dies wird bei der Genom-Editierung mit CRISPR/Cas9 genutzt, um gezielt Mutationen zu erzeugen. Homologe Reparatur ist besonders in Bakterien und Hefen verbreitet; in höheren Eukaryonten werden die meisten Doppelstrangbrüche nicht-homolog repariert. Homologe Wege sind vor allem in S- und G2-Phase aktiv, weil das nahe Schwester-Chromatid als Vorlage dienen kann. Von G1 bis zur frühen S-Phase überwiegt die nicht-homologe Reparatur.

Bei der homologen Reparatur werden zunächst die 5'-Enden durch den MRX-Komplex, bei Säugern und Pflanzen MRN, reseziert. Der Komplex besteht aus MRE11, Rad50 und XRCC1 (NBS1). Mit Rad51 und Rad54 bindet das einzelsträngige 3'-Ende an einen homologen Bereich, beispielsweise am Schwester-Chromatid, und bildet einen D-Loop. Nach dessen Vorlage wird der fehlende Strang synthetisiert. Zwei Holliday-Strukturen entstehen; ihre Auflösung kann zu einem Crossover oder zu einer Auflösung führen. Bei SDSA bindet ein offenes Ende an einen nicht homologen Bereich. Der Bruch wird repariert, aber Filler-Sequenzen aus dem Bereich des D-Loops werden eingebaut. Bei Single strand annealing können Brüche zwischen Repeats so weit verkürzt werden, dass längere homologe Bereiche paaren; dies führt zur Deletion des Bereichs zwischen den Repeats.

Die nicht-homologe Reparatur umfasst NHEJ und MMEJ. Beim Non-homologous end-joining (NHEJ) bindet der Ku-Komplex aus Ku70 und Ku80 an die Bruchenden, schützt sie vor Exonukleasen und stabilisiert den Bruch. Häufig werden kurze Mikrohomologien genutzt. MRX beziehungsweise MRN prozessiert die Enden, die dann durch den XRCC4-DNA-LigaseIV-Komplex verknüpft werden. Meist bleiben kleine Deletionen von wenigen Basen oder kleine Insertionen zurück.

Beim Microhomology-mediated end-joining (MMEJ) bindet Ku nicht, etwa in Knockout-Mutanten oder während S- oder G2-Phase. Die Enden werden über längere Mikrohomologien von 5–25 bp stabilisiert, durch MRX/MRN prozessiert und durch XRCC4/DNA-LigaseIV verbunden. Weil die Enden länger Exonukleasen ausgesetzt sind und größere Mikrohomologien genutzt werden, können größere Deletionen entstehen. Störungen solcher Systeme zeigen sich klinisch häufig als Chromosomenbruchsyndrom, etwa als Nijmegen-Breakage-Syndrom.

Quervernetzungen und Schadentoleranz

Quervernetzte DNA aktiviert in Wirbeltierzellen RAD18-SLF1-SLF2. RNF8/RNF168 ubiquitiniert danach die vernetzte DNA, woraufhin der SMC5/6-Proteinkomplex bindet.

Die Transläsionssynthese (TLS) toleriert DNA-Schäden, indem die Replikationsmaschinerie an Läsionen wie Thymindimeren oder AP-Stellen vorbeirepliziert. Reguläre Polymerasen werden dazu gegen spezialisierte Transläsions-Polymerasen ausgetauscht, beispielsweise DNA-Polymerase IV oder V aus der Y-Polymerase-Familie. Ihre größeren aktiven Stellen erleichtern das Einfügen von Basen gegenüber beschädigten Nukleotiden. Der Austausch wird unter anderem durch posttranslationale Modifikation von PCNA vermittelt. TLS-Polymerasen sind auf unbeschädigten Vorlagen oft ungenau, können gegenüber bestimmten Schäden aber korrekte Basen besonders effizient einfügen.

Pol η ermöglicht den fehlerfreien Bypass UV-induzierter Läsionen, während Pol ι dort Mutationen einführt. Über einem T^T-Photodimer fügt Pol η das erste Adenin mit Watson-Crick-Basenpaarung und das zweite in syn-Konformation mit Hoogsteen-Basenpaarung ein. Bei einer Läsion stoppt die Replikationsgabel: PCNA wird von einer prozessiven Polymerase zu einer TLS-Polymerase wie Pol ι umgeschaltet. Nach fehlerfreier TLS kann eine replikative Polymerase verlängern; bei einer Fehlpaarung kann Pol ζ verlängern, da sie terminale Missmatches verlängern kann. Anschließend wechselt PCNA wieder zu einer prozessiven Polymerase. Das Risiko von Punktmutationen kann für die Zelle vorteilhafter sein als Reparaturmechanismen, die grobe Chromosomenaberrationen oder Zelltod verursachen können.