CRISPR/Cas-Methode

Grundidee und Funktionsweise

Die CRISPR/Cas-Methode ist ein Verfahren des Genome Editing: DNA kann an einer vorher festgelegten Stelle geschnitten und dadurch gezielt verändert werden. Gene lassen sich entfernen, ausschalten oder einfügen; auch einzelne Nukleotide eines Gens können verändert werden. Das Verfahren beruht auf einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien und Archaea. Es wird in der Forschung vor allem genutzt, weil Zielsequenzen vergleichsweise einfach angepasst werden können, die Methode skalierbar ist und geringe Kosten verursacht.

Ein Cas-Protein ist ein DNA-schneidendes Enzym. Es bindet eine RNA, deren variabler Abschnitt durch Basenpaarung an eine komplementäre Ziel-DNA bindet. Die RNA verbindet somit Cas mit der gewünschten DNA-Stelle. Cas gelangt in deren Nähe und schneidet die DNA. Zwei Schnitte können eine DNA-Sequenz entfernen. Soll DNA eingefügt werden, wird meist eine DNA-Vorlage mit Enden bereitgestellt, die zu den beiden Schnittenden passen; die zelleigene DNA-Reparatur verbindet sie.

Nach einem Doppelstrangbruch repariert die Zelle die DNA durch homology-directed repair (HDR) oder non-homologous end joining (NHEJ). HDR ist bei der Methode wegen seiner Genauigkeit bevorzugt. Bei Prime Editing kann eine Einfügung ohne zusätzlich eingebrachte DNA erfolgen, weil die einzufügende Sequenz in einer RNA-Verlängerung codiert ist.

Bausteine, Zielwahl und Varianten

Beim häufig verwendeten Cas9 bestimmt eine crRNA (CRISPR-RNA), welche Ziel-DNA gebunden wird. Ihr spacer-Abschnitt ist der variable Adapter und komplementär zur Ziel-DNA; der repeat-Abschnitt bildet eine RNA-Sekundärstruktur, an die Cas9 bindet. Zusätzlich wirkt eine tracrRNA (trans-acting CRISPR RNA), die teilweise komplementär zur crRNA ist. Beide RNA-Stränge können als sgRNA (single guide RNA) in einem einzigen, teilweise selbsthybridisierenden RNA-Strang zusammengefasst werden.

Für Cas9 muss in der Ziel-DNA außerdem ein PAM-Motiv vorhanden sein: NGG, wobei N jede Nukleinbase und GG zwei Guanine bedeutet. Cas9 schneidet drei Nukleotide vor dem PAM. Die zielbindende RNA-Sequenz umfasst 20 Nukleotide; besonders die 12 PAM-nahen Nukleotide bestimmen die Bindungsspezifität. Durch Austausch dieses spacer-Abschnitts wird Cas9 auf eine andere DNA-Sequenz ausgerichtet. Die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Ziele heißt Multiplex Genome Editing.

Wichtige Komponenten sind crRNA, tracrRNA beziehungsweise sgRNA, Cas9 oder ein alternatives Cas-Enzym sowie bei gezielten Einfügungen eine Reparaturvorlage. Cas12a (Cpf1) und Cas12b bieten eine ähnliche Spannbreite möglicher Zielsequenzen. Cas9 benötigt zwei RNAs oder eine sgRNA, erzeugt stumpfe Enden und nutzt ein G-reiches PAM. Cpf1 benötigt eine RNA ohne tracrRNA, erzeugt sticky ends, schneidet distal zur Erkennungssequenz und nutzt ein T-reiches PAM. Cas12b benötigt zwei RNAs oder eine sgRNA und besitzt ebenfalls sticky ends, eine distale Schnittstelle und ein T-reiches PAM. TALEN und Zinkfingernukleasen sind Alternativen, erfordern zur Änderung ihrer Bindungsspezifität jedoch aufwändiges Proteindesign.

Beim Base Editing wird die DNA nicht doppeltsträngig geschnitten: Ein Fusionsprotein aus Cas9 ohne entsprechende Endonuklease-Aktivität und Cytidin-Deaminase kann Cytidin in Thymidin umwandeln; mit Adenosin-Deaminase wird Adenosin zu Guanosin. Beide Verfahren erzeugen Substitutionsmutationen. Cas13 dient dem RNA-Editing; dessen Wirkungen einschließlich möglicher RNA-Off-Target-Mutationen sind vorübergehend und nicht vererbbar.

Spezifität und technische Weiterentwicklungen

Eine zentrale Schwierigkeit sind off-target-Effekte, also Schnitte und Mutationen außerhalb der vorgesehenen Schnittstelle. Dazu zählen Punktmutationen, Deletionen, Insertionen, Inversionen und Translokationen. Teilweise sollen über 50 % der Schnitte off-target erfolgt sein. Weil sgRNAs Basenfehlpaarungen tolerieren, können mehrere tausend mögliche Bindungsstellen entstehen. Dies kann Experimente irreführend oder nicht reproduzierbar machen; als mögliches Sicherheitsproblem wird Krebs genannt. Ursachen sind Basenfehlpaarungen sowie Schleifenbildungen der sgRNA oder Ziel-DNA.

2015 injizierte ein chinesisches Forschungsteam 86 menschlichen Embryonen die korrekte Version des Beta-Globin-Gens, um einen Defekt bei Beta-Thalassämie zu korrigieren. Das korrekte Gen wurde nur in vier Fällen an der richtigen Stelle nachgewiesen; auch dort lag ein Mosaik vor.

Zur Verringerung unspezifischer Schnitte werden Software und Datenbanken zur Vorhersage sowie Nachweisverfahren für Mutationen entwickelt. Paired Nickases nutzen Cas9-Mutanten D10A oder H840A, die nur einen Strang schneiden. Zwei leicht versetzt bindende sgRNAs erhöhen die Spezifität; die versetzten Einzelstrangbrüche erzeugen sticky ends und können Einfügungen erleichtern. Einzelstrangbrüche werden durch Basenexzisionsreparatur und HDR geschlossen und führen zu weniger Mutationen als NHEJ.

Auch Cas9-Mutanten können helfen: D1135E von SpCas9 verändert die PAM-Bindungsspezifität, HF1 verringert unspezifische Schnitte. Bei dCas9-FokI wird nuclease-inaktives Cas9 mit FokI gekoppelt; weil FokI nur als Homodimer aktiv ist, sinkt die Zahl unspezifischer Schnitte auf 1/10.000. BhCas12b v4 (K846R/S893R/E837G) ist eine Mutante eines kleineren Cas12b aus Bacillus hisashii; sie erzeugt bei 37 °C Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte als der Wildtyp.

Prime Editing kombiniert dCas9 mit reverser Transkriptase und einer pegRNA. Diese enthält Bindungs- und RNA-Vorlagensequenz. So sind Insertionen, Deletionen und alle 12 möglichen Punktmutationen möglich, ohne mutationsanfällige Doppelstrangbrüche und bei Insertionen ohne separate DNA-Vorlage.

Systemtypen und Steuerung

Es gibt mehr als 40 Cas-Proteinfamilien. Sie werden in zwei Klassen, sechs Typen und mehr als 30 Subtypen eingeteilt. Klasse I umfasst die Typen I, III und IV und verwendet einen Effektorkomplex aus mehreren Proteinen. Klasse II mit den Typen II, V und VI verwendet jeweils ein einzelnes Effektorprotein. Typ I und II schneiden doppelsträngige DNA; Typ III-A bearbeitet dsDNA und RNA, Typ III-B einzelsträngige RNA oder DNA. Cas1 und Cas2 bilden bei allen Typen in Bakterien den spacer. Cas9 gehört zum Typ II und wird häufig eingesetzt, weil nur ein Protein nötig ist. Es stammt meist aus Streptococcus pyogenes (SpCas9) oder Staphylococcus aureus (SaCas9); die kodierende DNA von SaCas9 ist etwa 1000 Basenpaare kürzer.

Die Klassifizierung orientiert sich an Merkmalen des Effektormoduls, also der cas-Gene zur Identifizierung genetischen Materials. Eine Einteilung allein nach der Phylogenese von Cas1 erwies sich als unzureichend, weil Effektormodul und Adaptationsmodul – letzteres trägt zur Auswahl von Protospacern bei – wahrscheinlich durch Rekombination unabhängig gemischt werden können.

CRISPR/Cas kann zeitlich, räumlich oder abhängig vom Zellzyklus reguliert werden. Anti-CRISPR-Proteine hemmen das System; eine zeitliche Begrenzung kann damit auch unspezifische Schnitte senken. Lichtgesteuerte Fusionsproteine können CRISPR-Cas nur während Bestrahlung aktivieren, etwa AcrIIA4 mit dem lichtsensitiven LOV2 aus Avena sativa, genannt CASANOVA. Zelltypspezifische Promotoren vor Cas- und sgRNA-Genen begrenzen die Wirkung auf bestimmte Zelltypen; Cyclin-Promotoren können sie auf einen Zellzyklusabschnitt begrenzen.

Anwendungen in Forschung, Medizin und Züchtung

CRISPR/Cas wird für Gen-Knockouts, Deletionen, Insertionen und mögliche Gentherapien eingesetzt. Es dient unter anderem dazu, Genome von Hepatitis-B-Virus und HIV zu entfernen, Onkogene und Tumorentstehung zu untersuchen, unbekannte Genfunktionen aufzuklären und Mutationen bei induzierten pluripotenten oder embryonalen Stammzellen zu korrigieren. 2020 wurde CRISPR-Cas9 erstmals in einer klinischen Studie im menschlichen Körper eingesetzt: Zur Behandlung der Leberschen Kongenitalen Amaurose wurden drei Tropfen mit Milliarden Viren unter die Retina injiziert. Die DNA-Änderung ist permanent, aber nicht vererbbar. Vorläufige Ergebnisse zur Behandlung CTX001 wurden im Juni 2020 veröffentlicht; 2021 endete eine kleine Studie intravenöser CRISPR-Genbearbeitung mit erfolgversprechenden Ergebnissen.

Bei menschlichen Anwendungen kann Cas9 als bakterielles Antigen problematisch sein. Über 80 % gesunder Menschen zeigen sowohl eine Antikörper-basierte humorale als auch eine auf T-Gedächtniszellen beruhende zelluläre Immunantwort, nachdem sie mit S. pyogenes oder S. aureus Kontakt hatten. Editierte Körperzellen könnten dadurch von cytotoxischen T-Zellen erkannt und durch Apoptose zerstört werden.

Mit inaktivem Cas9 (dCas9) lassen sich Gene ohne Schneiden der DNA regulieren: CRISPRi bewirkt einen Knockdown, CRISPRa kann als dCas9-Aktivator-Fusion die Transkription auslösen. Cas-Mutanten mit grün fluoreszierendem Protein markieren DNA-Sequenzen, auch Telomere. Komplexe Genomveränderungen bei Mäusen konnten dadurch statt bis zu zwei Jahren in wenigen Wochen hergestellt werden.

In der Pflanzenzüchtung soll die Methode Nutzpflanzen leichter, effizienter und flexibler verändern. Für mehrere Arten gibt es Studien; laut Artikel waren noch keine CRISPR-Pflanzen auf dem Markt. 2021 kamen in Japan Tomaten mit fünffach erhöhtem Gehalt an möglicherweise leicht beruhigend wirkendem GABA auf den Markt. Bei Tieren kann etwa das Geschlecht beeinflusst werden; Hühner wurden so verändert, dass männliche Embryonen absterben, um das Töten männlicher Eintagsküken zu verhindern. Epigenom-Editing verändert nicht die DNA-Sequenz, sondern deren Präsentation und epigenomische Merkmale. RNA-Editing bearbeitet RNA statt DNA und gilt wegen der vorübergehenden, nicht vererbbaren Effekte als weniger riskant.

Entwicklung, Risiken und Rechtslage

CRISPR wurde 1987 erstmals beschrieben. 2011 zeigten Arbeitsgruppen um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna, dass sich spezifische DNA-Ziele in vitro schneiden lassen; ihre Arbeit wurde am 28. Juni 2012 in Science veröffentlicht. Parallel arbeitete Virginijus Šikšnys mit seiner Gruppe; deren Arbeit erschien am 4. September 2012 online in PNAS. Charpentier und Doudna erhielten 2020 den Nobelpreis für Chemie. Ein Patentstreit zwischen Berkeley und dem Broad Institute um grundlegende Patente ist nicht abschließend: Das US-Patentamt entschied im März 2022 zugunsten des Broad Institute, doch ein Bundesberufungsgericht hob dies im Mai 2025 auf und verwies den Fall zur erneuten Prüfung zurück.

Die Methode wird als einfach, preiswert, leicht verfügbar, punktgenau und effizient beschrieben. Kritiker fordern internationale Standards und Vorsorgemaßnahmen gegen Missbrauch, auch durch DIY-Biohacker. Beim Eingriff in die menschliche Keimbahn bestehen bioethische Bedenken. Der Deutsche Ethikrat warnt angesichts noch unausgereifter Verfahren vor unerwünschten gesundheitlichen sowie nicht absehbaren ethischen Folgen.

Der Europäische Gerichtshof entschied am 25. Juli 2018 (Az. C-528/16), dass mit CRISPR/Cas bearbeitete Pflanzen ohne Fremd-DNA grundsätzlich als gentechnisch veränderte Organismen gelten und den Pflichten der GVO-Richtlinie unterliegen. Die Europäische Kommission schlug im Sommer 2023 vor, gen-editierte Pflanzen wie herkömmliche Züchtungen zu behandeln, wenn sie auch natürlich oder durch gezielte Züchtung hätten entstehen können. Das Europäische Parlament unterstützte am 8. Februar 2024 diesen Vorschlag mit 307 zu 263 Stimmen bei 41 Enthaltungen, verlangte aber zusätzlich eine Kennzeichnung von Waren mit Bestandteilen aus neuen genomischen Techniken. Im Ökolandbau soll ihre Verwendung verboten bleiben.