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Loop-mediated Isothermal Amplification
Im Gegensatz zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der die Reaktion mit einer Reihe von alternierenden Temperaturschritten oder Zyklen durchgeführt wird …
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Grundprinzip und Eigenschaften
Die loop-mediated isothermal amplification (LAMP; „schleifen-vermittelte isothermale Amplifikation“) ist ein Verfahren zur Amplifikation, also zur Vervielfältigung, von DNA. Sie gehört zu den isothermen Nukleinsäure-Amplifikationstechniken. Anders als bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die aus wechselnden Temperaturschritten oder Zyklen besteht, läuft LAMP bei konstanter Temperatur ab. Deshalb ist kein Thermocycler erforderlich.
LAMP nutzt eine strangversetzende DNA-Polymerase, beispielsweise Bst-DNA-Polymerase oder Bst 2.0. Strangverdrängung bedeutet, dass die Polymerase beim Aufbau eines neuen DNA-Strangs einen bereits vorhandenen Strang verdrängen kann. Die Reaktion kann durch Zugabe von Polyethylenglykol mit 8.000 bis 20.000 Dalton beschleunigt werden.
Für LAMP binden vier bis sechs Primer an sechs bis acht DNA-Sequenzen. Primer sind kurze DNA-Stücke, die den Startpunkt für die DNA-Synthese festlegen. Das Primerdesign ist daher aufwändiger als bei anderen Amplifikationsmethoden. Durch eine zusätzliche reverse Transkriptase kann – ähnlich wie bei der RT-PCR – eine reverse Transkription erfolgen. Dadurch kann RNA zunächst in DNA umgeschrieben und anschließend amplifiziert werden. Wie bei der qPCR ist eine Quantifizierung der entstandenen DNA möglich; außerdem können, ähnlich wie bei einer Multiplex-PCR, mehrere DNA-Sequenzen parallel nachgewiesen werden.
Ablauf und Nachweis der Produkte
Die Zielsequenz wird bei 60–65 °C amplifiziert. Dazu werden zwei oder drei Primer-Sets sowie eine Polymerase eingesetzt, die neben der Replikationsaktivität eine hohe Strangverdrängungsaktivität besitzt. Üblicherweise dienen vier verschiedene Primer zur Amplifikation von sechs Regionen eines Zielgens. Dies erhöht die Spezifität, also die Wahrscheinlichkeit, tatsächlich die gesuchte Zielsequenz nachzuweisen. Ein zusätzliches Paar von Schleifenprimern kann die Reaktion weiter beschleunigen. Die bei LAMP gebildete DNA-Menge ist wesentlich höher als bei PCR-basierter Amplifikation.
Das Amplifikationsprodukt kann photometrisch nachgewiesen werden. Dabei wird die Trübung gemessen, die durch Magnesiumpyrophosphat-Präzipitat als Nebenprodukt der Amplifikation entsteht. Der Nachweis ist dadurch mit bloßem Auge oder mit einfachen photometrischen Verfahren in kleinen Volumina möglich. Die Reaktion lässt sich auch in Echtzeit verfolgen: entweder über die Trübung oder über Fluoreszenz interkalierender Farbstoffe wie SYTO 9. Interkalierende Farbstoffe lagern sich in DNA ein. SYBR green kann sichtbare Farbänderungen erzeugen oder instrumentell genauer gemessen werden. Da die Farbstoffsignale mit der ursprünglich vorhandenen Kopienzahl korreliert werden können, kann LAMP quantitativ eingesetzt werden.
Mangan-beladenes Calcein ermöglicht ebenfalls einen Fluoreszenznachweis im Reagenzglas: Wenn Pyrophosphat bei der in-vitro-DNA-Synthese Mangan komplexiert, beginnt Calcein zu fluoreszieren. Ein weiterer visueller Nachweis verwendet goldgebundene einzelsträngige DNA (ss-DNA). LAMP-Amplikons können mit komplementärer ss-DNA hybridisieren und dadurch verhindern, dass Goldpartikel bei salzinduzierter Aggregation ihre Farbe normalerweise von Rot zu Violett-Blau ändern. Die Kombination aus LAMP und Amplikon-Detektion durch AuNP kann die Testzeit verkürzen, die Amplikons durch Hybridisierung bestätigen und ohne Thermocycler, Elektrophoresegerät oder UV-Transilluminator auskommen.
Einsatz und Vorteile
LAMP gilt als relativ neue DNA-Amplifikationstechnik mit möglichen Vorteilen durch Einfachheit, Robustheit und geringe Kosten. Sie kann als einfacher Screening-Test vor Ort oder am Ort der Behandlung durch klinisches Personal eingesetzt werden. Weil die Methode isotherm arbeitet und keine teuren Thermocycler benötigt, könnte sie besonders für die Diagnose von Infektionskrankheiten in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen nützlich sein.
LAMP wird umfangreich für den Nachweis von Filariose, Zika-Virus, Tuberkulose, Malaria, Schlafkrankheit und SARS-CoV-2 untersucht. Für weitere häufige Krankheitserreger muss die Methode in Entwicklungsregionen noch umfassend validiert werden.
In komplexen Proben wie Blut reagiert LAMP weniger empfindlich, also resistenter, auf Inhibitoren als PCR. Als wahrscheinlicher Grund wird die andere Polymerase genannt: Bei LAMP wird in der Regel Bst-DNA-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus verwendet, bei PCR dagegen Taq-Polymerase. Berichtet wurde ein erfolgreicher Erregernachweis aus minimal verarbeiteten Proben, etwa hitzebehandeltem Blut, oder bei Anwesenheit klinischer Probenmatrices. Dies kann dort hilfreich sein, wo eine herkömmliche DNA- oder RNA-Extraktion vor dem diagnostischen Test unpraktisch ist.
Grenzen und mögliche Fehlerquellen
LAMP ist weniger vielseitig als PCR, die am weitesten verbreitete Nukleinsäure-Amplifikationstechnik. Sie eignet sich vor allem für Diagnose und Nachweis, nicht jedoch für das Klonen oder viele andere molekularbiologische Anwendungen der PCR. Bei LAMP richten sich 4 oder 6 Primer gegen 6 oder 8 Regionen eines relativ kleinen Genomsegments. Wegen zahlreicher Vorgaben beim Primerdesign lassen sich geeignete Primersätze nur schwer „nach Augenmaß“ erstellen; meist unterstützen kostenlose, quelloffene oder kommerzielle Softwarepakete. Gegenüber PCR besteht zudem weniger Freiheit bei der Wahl der Zielregion.
Bei diagnostischen Anwendungen muss ein passendes Ziel gewählt werden, zum Beispiel eine konservierte Stelle in einem stark variablen viralen Genom oder ein für einen Erregerstamm spezifisches Ziel. Um Varianten einer Spezies abzudecken, können mehrere degenerierte Sequenzen nötig sein. Ein solcher Primer-Cocktail kann in der Spätamplifikation zu unspezifischer Amplifikation führen.
Multiplexing ist bei LAMP weniger weit entwickelt als bei PCR. Die vielen Primer je Ziel erhöhen die Wahrscheinlichkeit von Primer-Primer-Interaktionen. LAMP erzeugt Konkatemere der Zielregion, also hintereinander geschaltete Wiederholungen. Im Gel entsteht daher ein charakteristisches Leiter- oder Bandenmuster statt einer einzelnen Bande wie bei PCR. Die Identifikation verschiedener Ziele anhand einer einzelnen Bandengröße, wie bei traditionellen Endpunkt-Multiplex-PCR-Anwendungen, ist mit LAMP nicht möglich. Multiplexing wurde durch Auswahl einer Zielregion mit Restriktionsstelle und anschließenden Verdau vor der Gelanalyse erreicht; jedes Produkt erhält dann eine bestimmte Fragmentgröße. Dieser Ansatz erhöht jedoch die Komplexität von Versuchsplanung und Protokoll.
Strangverdrängende Polymerasen schließen Hydrolyse-Sonden wie TaqMan-Sonden aus, da diese die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase benötigen. Ein Echtzeit-Multiplexing mit Fluoreszenzlöschern wurde als Alternative berichtet. SYBR-grüner Farbstoff erlaubt Echtzeitbeobachtung, doch in der Spätamplifikation können Primer-Dimere falsch-positive Signale verursachen. Anorganische Pyrophosphatase in einer SYBR-Reaktionsmischung ermöglicht eine Schmelzanalyse zur Unterscheidung korrekter Amplifikation. Trotz vorgeschlagener Gegenmaßnahmen bleibt unspezifische Amplifikation eine der wichtigsten Einschränkungen, unter anderem weil Temperatur-Gating-Mechanismen fehlen.
