Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Biochemie - Labormethoden  - AMBOSS Video
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0:04 PCR Definition Die Polymerasekettenreaktion, kurz PCR, fuer
0:07 Englisch polymerase chain reaction, ist eine Standardmethode der Molekularbiologie zur Vervielfaeltigung bestimmter Abschnitte doppelstraengiger DNA.
0:18 Grundprinzip Die PCR beruht auf den Mechanismen der zellulaeren DNA-Replikation, wird aber in vitro durchgefuehrt.
0:27 Das Grundprinzip ist dabei relativ simpel: Zuerst wird die doppelstraengige DNA, das so genannte Template, durch Hitze getrennt.
0:36 Anschliessend synthetisiert eine DNA-Polymerase an jedem Einzelstrang in jeweils eine Richtung einen neuen Tochterstrang.
0:42 Durch mehrfache Wiederholungen dieser Reaktionen wird ein spezifisch festgelegter DNA-Abschnitt exponentiell vervielfaeltigt, d.h. amplifiziert.
0:53 Schon sehr kleine Mengen Ausgangs-DNA genuegen fuer die erfolgreiche Amplifikation des gewuenschten DNA-Abschnitts, da die Reaktion hoch spezifisch ablaeuft und eine sehr starke Vervielfaeltigung
1:04 stattfindet. Detaillierter Ablauf Wie funktioniert der Reaktionsablauf im Detail?
1:08 Zu Beginn des ersten Reaktionszyklus’ enthaelt der Reaktionsansatz folgendes: Doppelstraengige Ausgangs-DNA Vier verschiedene Nukleotide als Bausteine
1:19 der DNA - das sind im Einzelnen Desoxyadenosintriphosphat Desoxyguanosintrisphosphat Desoxycytidintriphosphat und
1:29 Desoxytymidintriphosphat DNA-Polymerase Hier verwendet man eine besondere, naemlich hitzestabile DNA-Polymerase.
1:40 Sie ist auch nach dem Erhitzen auf hohe Temperaturen, die zur Denaturierung der DNA notwendig sind, noch funktionstuechtig.
1:47 Solche Polymerasen stammen aus thermophilen Bakterien, z.B. Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus.
1:54 Und schliesslich enthaelt der Reaktionsansatz noch zwei verschiedene sogenannte Primer. Das sind zwei kurze Oligonukleotide unterschiedlicher Nukleotidsequenz, die der DNA-Polymerase als
2:05 Anknuepfungspunkt fuer das naechste passende Nukleotid dienen. Jeder der Primer begrenzt den einen der zu amplifizierenden DNA-Straenge in eine Richtung.
2:14 Die Reaktion laeuft folgendermassen ab: Denaturierung Die Temperatur wird zuerst auf 90°C erhoeht,
2:21 wodurch die DNA denaturiert und sich in Einzelstraenge auftrennt. Annealing Im naechsten Schritt wird die Temperatur auf
2:27 die sogenannte Annealing-Temperatur von 50-60°C gesenkt. Jetzt koennen sich die Primer an die komplementaeren DNA-Sequenzen anlagern.
2:36 Elongation In der nun folgenden Elongationsphase wird die Temperatur wieder auf ca.
2:41 70°C erhoeht. Dies ist die optimale Arbeitstemperatur der DNA-Polymerase, bei der sie die Nukleotide
2:47 an die Primer anhaengt. Jeder Primer wird immer nur an seinem 3’OH-Ende verlaengert, dem Anknuepfungspunkt fuer das
2:56 naechste, komplementaere Desoxyribonukleotid. Im ersten Reaktionszyklus erhaelt man noch zwei zu lange DNA-Straenge, die jeweils auf
3:05 einer Seite ueber den gewuenschten Abschnitt hinausgehen. Das zu amplifizierende DNA-Fragment liegt jetzt insgesamt viermal vor.
3:12 Es wurde also verdoppelt. Im zweiten Reaktionszyklus wird die Temperatur zuerst wieder auf 90°C erhoeht ((Denaturierung)).
3:20 Die im Reaktionsgemisch vorhandenen doppelstraengigen DNA-Molekuele denaturieren. Im folgenden Schritt wird die Temperatur wieder auf die Annealing-Temperatur gesenkt.
3:29 Die Primer lagern sich sequenzspezifisch an ((Annealing)). Im folgenden Schritt synthetisiert die DNA-Polymerase wieder die komplementaeren DNA-Straenge bei
3:38 ihrer Arbeitstemperatur von ca. 70°C ((Elongation)).
3:41 Nach dem zweiten Reaktionszyklus wurde wiederum die im Reaktionsgemisch vorhandene DNA verdoppelt. Jetzt finden sich auch schon zwei DNA-Molekuele, die in ihrer Laenge genau dem zu amplifizierenden
3:53 DNA-Abschnitt entsprechen. Im dritten Reaktionszyklus verdoppelt sich die vorhandene DNA-Menge wieder nach dem gleichen
4:00 Ablauf: Denaturierung, Annealing, Elongation. Mit jedem weiteren Zyklus der PCR erhaelt man immer mehr DNA-Molekuele, die dem gewuenschten
4:11 Abschnitt auf der Ausgangs-DNA entsprechen. Im Verhaeltnis ist die Anzahl der anfaenglich noch zu langen DNA-Molekuele verschwindend
4:19 gering, denn ihre Anzahl steigt nur linear an, wohingegen die Menge der Produkte mit der gewuenschten Laenge exponentiell waechst.
4:26 Nach ca. 30 Zyklen wurde das durch die Wahl der Primer festgelegte DNA-Fragment je nach Effizienz
4:32 der Reaktion um den Faktor 106 bis 1012 amplifiziert. Weitere Verwendung/Analyse Die amplifizierte DNA kann jetzt analysiert
4:43 werden. Dazu wird diese meist in einer Gelelektrophorese sichtbar gemacht.
4:47 So kann z.B. eine mittels PCR vervielfaeltigte Erreger-DNA nachgewiesen werden. Dank der hohen Spezifitaet der Reaktion ist es moeglich, auch schwer oder gar nicht kultivierbare
4:59 Mikroorganismen nachzuweisen. Alternativ kann die DNA auch weiterverwendet und z.B. in ein Bakteriengenom transferiert
5:07 werden. Diese gentechnische Methode wird verwendet, um bestimmte, therapeutisch eingesetzte Proteine
5:12 herzustellen, z.B. rekombinantes Humaninsulin.