Multiplex-PCR

Grundidee und Bedeutung

Die Multiplex-PCR ist eine Anwendungsform der diagnostischen PCR. PCR wurde zunächst vor allem zur Amplifizierung, also zur Vervielfältigung, von DNA für die Sequenzierung eingesetzt. Bei der Sequenzierung wird die Basenabfolge der vervielfältigten DNA bestimmt. Durch den Fortschritt der Sequenzierungsprojekte und die Kenntnis der Basenabfolge im Genom eines Organismus konnten spezifische Sequenzen sowie mit Krankheiten verbundene Sequenzveränderungen ermittelt werden. Für solche Sequenzen werden diagnostische PCR-Verfahren entwickelt.

Eine PCR zum Nachweis eines bestimmten Abschnitts im Genom heißt Singleplex-PCR oder Einzel-PCR. Bei vielen Erkrankungen kommen jedoch verschiedene Viren, Bakterien oder genomische Veränderungen als Ursache infrage. Dann müssten mehrere Singleplex-PCR-Nachweise durchgeführt werden. Die Multiplex-PCR fasst diese Nachweise in einem gemeinsamen PCR-Ansatz zusammen und kann dadurch die Ursache einer Erkrankung gezielter untersuchen.

Prinzip und Entwicklung

Bei der Multiplex-PCR werden mehrere einzelne PCR-Verfahren nicht in getrennten Reaktionen, sondern gemeinsam in einer PCR-Reaktion durchgeführt. Sie ist damit ein PCR-Ansatz mit dem Potenzial, mehr als einen Genomabschnitt nachzuweisen. Der wesentliche Vorteil besteht darin, dass der Aufwand für die Bestimmung der Krankheitsursache sinkt, insbesondere bei Kosten und Zeit.

Die Entwicklung einer Multiplex-PCR ist allerdings aufwendiger als die Entwicklung einer einzelnen PCR. Wegen der größeren Anzahl an Primern und, bei einer Gestaltung als real-time PCR, auch an Sonden treten Wechselwirkungen zwischen diesen Oligonukleotiden wahrscheinlicher und häufiger auf. Solche Wechselwirkungen können die Sensitivität, also die Empfindlichkeit des Nachweises, verringern. Deshalb müssen sie bei der Entwicklung ausgeschlossen oder vermieden werden.

Aktueller Stand und interne Kontrolle

Unter realen Bedingungen ist es sehr schwierig, Wechselwirkungen zwischen den Oligonukleotiden vollständig auszuschließen. Sensitive Multiplex-PCR-Anwendungen sind deshalb aktuell vor allem Duplex-PCR. Häufig wird der Nachweis der gesuchten Genomsequenz mit einer internen Amplifikationskontrolle kombiniert. Verfahren mit bis zu vier PCR-Nachweisen pro Ansatz sind jedoch keine Seltenheit mehr.

Eine Amplifikationskontrolle ist bei vielen diagnostischen PCR-Anwendungen vorgeschrieben, um falsch negative Ergebnisse auszuschließen. Solche Ergebnisse können entstehen, wenn die untersuchte DNA Inhibitoren enthält. Das sind Stoffe, die die enzymatische Aktivität der Taq-Polymerase hemmen; als wichtige Beispiele nennt der Artikel Eisen-Ionen aus roten Blutzellen.

Für die Kontrolle wird eine zweite PCR-Reaktion konstruiert und der PCR-Ansatz mit einer kleinen Menge der Ziel-DNA für diese Reaktion versetzt. Ist der Nachweis der gesuchten Genomsequenz negativ, muss die Amplifikationskontrolle positiv sein. Dadurch wird bestätigt, dass keine PCR-Inhibitoren vorhanden sind und das negative Ergebnis daher als richtig gelten kann.

Abgrenzung und Ausblick

Einige Unternehmen bezeichnen aus Marketinggründen auch Nachweiskits mit mehreren getrennten PCR-Ansätzen als Multiplex-PCR. Nach dem Artikel handelt es sich dabei nicht um eine wirkliche Multiplex-PCR, weil bei dieser die Nachweise gemeinsam in einer einzigen PCR-Reaktion stattfinden.

Wegen der vielen diagnostischen Probleme mit einer Vielzahl möglicher Ursachen ist mit einer weiteren Verbreitung der Multiplex-PCR zu rechnen. Genannt werden insbesondere die Sepsis-Analytik, die Diagnose von Atemwegserkrankungen, die Krebsdiagnostik, der Nachweis gentechnisch veränderter Organismen (GVO) und die Bestimmung der Ursache von Durchfallerkrankungen. Erwartet werden außerdem eine weitere Erhöhung der Multiplex-Anzahl und eine stärkere Nutzung der Detektion mittels real-time PCR.