Intrinsisch ungeordnete Proteine

Definition und Bedeutung

Ein intrinsisch ungeordnetes Protein (IDP, englisch intrinsically disordered protein) ist ein Protein, dem eine feste oder geordnete dreidimensionale Struktur fehlt. Der Begriff umfasst vollständig unstrukturierte und teilstrukturierte Proteine, darunter Random Coils und (pre-)molten globules. Auch Proteine mit mehreren Domänen, die durch kurze, bewegliche Peptidsequenzen verbunden sind, können dazugehören. Intrinsisch unstrukturierte Proteine bilden eine Untergruppe der IDPs, obwohl beide Bezeichnungen in der Literatur manchmal synonym verwendet werden.

IDPs sind besonders an Signaltransduktion, Transkription und der Umgestaltung des Chromatins beteiligt. Ihre Beweglichkeit erlaubt es ihnen, ihre Konformation an die Bedingungen in der Zelle und an unterschiedliche Bindungspartner anzupassen. Manche IDPs nehmen erst durch die Bindung an ein anderes Makromolekül eine feste Struktur an. Damit zeigen sie, dass eine dauerhaft stabile Proteinstruktur keine notwendige Voraussetzung für biologische Funktion ist.

Schätzungen zufolge sind etwa 10 % der Proteine ungeordnet; außerdem besitzen 40 % der eukaryotischen Proteine mindestens eine lange, aus mehr als 50 Aminosäuren bestehende ungeordnete β-Schleife. Solche Regionen wurden in Kristallstrukturen früher teilweise als zufällige Lücken angesehen. Fehlende Atomkoordinaten können jedoch auf intrinsisch ungeordnete Regionen hinweisen.

Struktur und charakteristische Eigenschaften

IDPs liegen nicht nur in einer einzigen Form vor. Die Gesamtheit ihrer möglichen Konformationszustände heißt structural oder conformational ensemble. Nur ein geringer Teil ist im nativen Zustand vollständig ungeordnet. Viele IDPs enthalten stattdessen bestimmte intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs), die den Grad der Unordnung wesentlich bestimmen. Deshalb unterscheidet man vollständig ungeordnete, intrinsisch unstrukturierte Proteine von Proteinen, die neben geordneten Bereichen einzelne IDRs besitzen. SUMO-1 ist beispielsweise im Zentralbereich relativ geordnet, während seine N- und C-terminalen Regionen ungeordnet sind.

Art und Ausmaß der Unordnung werden durch die Aminosäuresequenz bestimmt. IDPs enthalten meist wenige sperrige Aminosäuren, dafür viele polare und elektrisch geladene Aminosäuren. Dadurch besitzen sie eine niedrige Hydrophobizität und können gut mit Wasser wechselwirken. Eine hohe Gesamtladung fördert zugleich die elektrostatische Abstoßung gleich geladener Aminosäurereste. Deshalb kann häufig kein dicht gepackter hydrophober Kern entstehen, wie er für globuläre Proteine typisch ist. Hydrophobe Cluster innerhalb einer IDR können jedoch darauf hinweisen, welche Bereiche bei einer Bindung eine Struktur ausbilden.

Viele IDPs besitzen keine regelmäßigen Sekundärstrukturen und gelten daher als flexibel. Flexibilität bezeichnet hier keinen einzelnen Gleichgewichtszustand wie bei strukturierten Proteinen. Häufig treten außerdem low-complexity regions (LCRs) auf, in denen wenige Aminosäurereste oder bestimmte Motive überrepräsentiert sind. LCRs können auf Unordnung hindeuten, kommen aber nicht in allen IDPs vor.

Funktionelle Elemente und Bindung

Ungeordnete Regionen treten häufig als flexible linkers oder Schleifen zwischen Proteindomänen auf. Solche Verbindungselemente unterscheiden sich stark in ihrer Länge und sind reich an polaren Aminosäuren. Sie ermöglichen den verbundenen Domänen, sich zu drehen und gegeneinander zu bewegen. Dadurch können Bindungspartner leichter erreicht werden. Die Bindung an andere Proteine kann diesen ebenfalls zusätzliche Konformationsänderungen durch weitreichende Allosterie ermöglichen.

Lineare Motive sind kurze Proteinabschnitte, die Interaktionen mit Proteinen oder anderen Biomolekülen wie DNA, RNA oder Zuckern vermitteln. Sie steuern unter anderem die Zellstruktur, die subzelluläre Lokalisation von Proteinen und den Proteinumsatz. Posttranslationale Modifikationen, also chemische Veränderungen nach der Herstellung eines Proteins, verändern häufig ihre Bindungsaffinität; ein Beispiel ist die Phosphorylierung. Kernspinresonanz-Untersuchungen fanden bei 80 % der IDPs sogenannte PreSMos (pre-structured motifs). Das sind kurzzeitig auftretende Sekundärstrukturen, die an der Erkennung eines Zielmoleküls beteiligt sind. Bei der Bindung können sie stabil werden und beispielsweise Helices bilden. Vermutlich stellen PreSMos die aktiven Zentren vieler IDPs dar.

Bei der gekoppelten Faltung und Bindung geht ein ungeordneter Abschnitt während der Bindung lokal in einen geordneteren Zustand über. Dazu gehören Molecular recognition features (MoRFs). Dieser Vorgang kann nur wenige Aminosäurereste oder eine ganze Domäne betreffen. Solche Bereiche wirken als molekulare Schalter und reagieren beispielsweise auf kleine Moleküle, DNA, RNA oder Ionen. Kurze lineare Motive sind in ungeordneten Proteinen besonders häufig. RNA-Viren wie Henipaviren, das Hepatitis-C-Virus, HIV-1 und humane Papillomviren nutzen zahlreiche ungeordnete Bereiche und lineare Motive, um verschiedene Wirtsproteine zu binden und zu beeinflussen.

Ein IDP muss auch nach der Bindung nicht vollständig geordnet sein. In einem Fuzzy-Komplex kann es seine Konformation im gebundenen Zustand weiterhin ändern; die Unordnung kann statisch oder dynamisch sein und ist für die biologische Funktion notwendig. Bei DNA-bindenden Proteinen kann alternatives Spleißen die Länge solcher Fuzzy-Regionen und dadurch die Bindungsspezifität verändern.

Experimenteller Nachweis

Die wichtigste Methode zur Untersuchung ungeordneter Proteinregionen ist die NMR-Spektroskopie, also die Kernspinresonanz-Spektroskopie. Auch fehlende Elektronendichte in einer Kristallstrukturanalyse kann auf eine ungeordnete Region hinweisen. In PDB-Dateien werden fehlende 3D-Strukturen als REMARK465 gekennzeichnet.

Gefaltete Proteine besitzen eine hohe Dichte mit einem partiellen spezifischen Volumen von 0,72–0,74 mL/g und einen vergleichsweise kleinen Streumassenradius. Unterschiede in Molekülgröße, Dichte oder Wasserwiderstand lassen sich daher mit Gel-Permeations-Chromatographie, analytischer Ultrazentrifugation, Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) und Messungen des Diffusionskoeffizienten untersuchen. Der Mangel an Sekundärstrukturen kann mit fernem UV-Licht im Bereich von 170–250 nm, Circulardichroismus mit einem ausgeprägten Minimum bei etwa 200 nm oder IR-Spektroskopie erkannt werden. Weil die Peptidbindungen ungefalteter Proteine dem Lösungsmittel ausgesetzt sind, werden diese Proteine leichter von Proteasen gespalten und zeigen einen Wasserstoff-Deuterium-Austausch. Ihre Amid-Protonen besitzen bei der ¹H-NMR eine geringe Verschiebungsverteilung von weniger als 1 ppm; bei gefalteten Proteinen beträgt sie typischerweise 5 ppm.

FASTpp (Fast parallel proteolysis) kann gefaltete und ungeordnete Anteile ohne vorherige Proteinreinigung bestimmen. Vollständig ungeordnete Regionen werden bereits bei niedrigen Protease-Konzentrationen und kurzer Einwirkungszeit gespalten. Weitere Methoden liefern unterschiedliche Informationen: SAXS beschreibt conformational ensembles, NMR Details auf atomarer Ebene, Fluoreszenz Molekülinteraktionen und Konformationsänderungen, Kryoelektronenmikroskopie feste Strukturen, dynamische Lichtstreuung Größenverteilungen oder Aggregationskinetik und Circulardichroismus Sekundärstrukturen. Einzelmolekülmethoden sind unter anderem spFRET, optische und magnetische Pinzetten, Nanoporen sowie schnelle Rasterkraftmikroskopie.

Datenbanken und computergestützte Vorhersage

Algorithmen können intrinsische Unordnung oder eine entsprechende Tendenz mit einer Genauigkeit von etwa 80 % vorhersagen. Grundlage sind die Aminosäurezusammensetzung, Ähnlichkeiten zu unbestimmten Abschnitten in Kristallstrukturdaten, flexible Regionen aus NMR-Untersuchungen und physikochemische Eigenschaften der Aminosäuren. Solche Berechnungen sind wichtig, weil eine vollständige experimentelle Beschreibung der vielen möglichen IDP-Konformationen sehr zeitaufwendig und teuer wäre.

Als Unordnung fördernd gelten Alanin, Arginin, Glycin, Glutamin, Serin, Prolin, Glutaminsäure und Lysin. Feste Strukturen werden eher durch Tryptophan, Cystein, Phenylalanin, Tyrosin, Isoleucin, Valin, Leucin und Asparagin begünstigt. Histidin, Methionin, Threonin und Asparaginsäure kommen sowohl in geordneten als auch in ungeordneten Regionen vor. Diese Einteilung bildet eine Grundlage sequenzbasierter Verfahren. Auch NORS-Regionen ohne regelmäßige Sekundärstruktur und low-complexity regions lassen sich erkennen.

IUPRED und Disopred sind Beispiele für Vorhersageprogramme. Manche Verfahren nutzen Informationen über kurze lineare Motive und Protein-Interaktionsstellen, andere neuronale Netzwerke oder Matrizenrechnungen. Meta-Software verbindet mehrere Programme und kann dadurch genauere Ergebnisse liefern. Die Verfahren definieren „Unordnung“ jedoch unterschiedlich, weshalb ihre relative Genauigkeit schwer zu vergleichen ist. Das Gemeinschaftsexperiment CASP prüft unter anderem, wie genau Methoden Proteinregionen ohne bestimmte 3D-Struktur erkennen.

DisProt sammelt Proteinsequenzen mit experimentell nachgewiesener intrinsischer Unordnung. MobiDB verbindet solche Daten unter anderem mit fehlenden Aminosäureresten aus Kristallstrukturen und flexiblen Bereichen aus NMR-Strukturen. Für die Interpretation experimenteller Mittelwerte werden außerdem Computersimulationen eingesetzt. All-atom-Molekulardynamik kann conformational ensembles simulieren, benötigt wegen der strukturellen Vielfalt aber lange Laufzeiten und hohe Rechenleistung. Für IDPs optimierte Kraftfelder sind beispielsweise CHARMM 22*, CHARMM 32 und Amberff03*. Weitere Ansätze sind restrained-MD, accelerated-MD, replica exchange, metadynamics, multicanonical MD und vereinfachte Proteinmodelle.

Medizinische Bedeutung

IDPs spielen bei verschiedenen Krankheiten eine Rolle. Fehlgefaltete Proteine können sich zusammenlagern; solche Aggregationen können zu Synucleinopathien führen. Ein wichtiges Beispiel ist das intrinsisch ungeordnete Protein α-Synuclein. Seine strukturelle Flexibilität und seine Anfälligkeit für intrazelluläre Modifikationen können Fehlfaltung und Aggregation begünstigen. Genetische Dispositionen, oxidativer und nitrosativer Stress sowie mitochondriale Beeinträchtigungen können die strukturelle Flexibilität des ungefalteten α-Synucleins verändern und ebenfalls zu Synucleinopathien beitragen.

Auch viele Tumorsuppressoren, darunter p53 und BRCA1, besitzen zahlreiche intrinsisch ungeordnete Regionen. Diese beweglichen Abschnitte ermöglichen ihre Wechselwirkungen mit anderen Proteinen und sind damit für ihre Funktion bedeutsam.