Blau-Weiß-Selektion

Grundidee und Zweck

Die Blau-Weiß-Selektion ist eine gentechnische Methode, mit der bakterielle Klone erkannt werden, die ein Transgen enthalten. Ein Transgen ist ein eingefügtes DNA-Stück. Die Methode hilft nach einer Transformation zu prüfen, welche Bakterien ein Plasmid aufgenommen haben und ob dieses Plasmid an der vorgesehenen Stelle verändert wurde.

Ein Plasmid ist ein kleines, meist ringförmiges DNA-Molekül, das in Bakterien zusätzlich zum Bakterienchromosom vorkommen kann. In der Blau-Weiß-Selektion dient es meist als Klonierungsvektor, also als Träger für ein einzufügendes DNA-Stück. Wichtig ist dabei eine sichtbare Unterscheidung: Kolonien ohne erfolgreiche Insertion werden blau, Kolonien mit unterbrochenem Markergen bleiben ungefärbt beziehungsweise weiß.

Auswahl plasmidhaltiger Bakterien

Zunächst müssen Bakterien erkannt werden, die überhaupt ein Plasmid aufgenommen haben. Dafür tragen die verwendeten Plasmide ein Gen für eine Antibiotikaresistenz, die der verwendete Bakterienstamm nicht schon von selbst besitzt.

Nach der Transformation werden die Bakterien auf einem Kulturmedium mit dem passenden Antibiotikum kultiviert. Idealerweise überleben dort nur Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben. Diese Antibiotikaselektion beantwortet aber noch nicht, ob das gewünschte Transgen richtig in das Plasmid eingefügt wurde; dafür dient die Blau-Weiß-Unterscheidung.

LacZ als Reportergen

Für die Blau-Weiß-Selektion werden Plasmide verwendet, die an der Einfügestelle für das Transgen, der Multiple Cloning Site, das lacZ-Gen enthalten. Die Multiple Cloning Site ist ein Abschnitt im Plasmid, in den DNA-Fragmente eingefügt werden können. Das lacZ-Gen codiert für die β-Galactosidase, auch Galactosidase genannt, und wird hier als Reportergen genutzt. Ein Reportergen macht einen genetischen Vorgang indirekt sichtbar.

Wird ein Transgen in die Multiple Cloning Site eingefügt, wird die Galactosidase inaktiviert. Bakterien mit einem erfolgreich eingefügten DNA-Stück bilden dann keine funktionsfähige Galactosidase. Bakterien ohne solche Insertion können dagegen eine funktionsfähige Galactosidase besitzen und werden später blau sichtbar.

Alpha-Komplementation und Farbreaktion

Damit die Methode funktioniert, verwendet man spezielle Mutantenstämme, zum Beispiel E. coli JM109, DH5α und XL1-Blue. Diese Stämme enthalten Mutationen wie lacZΔM15, die verhindern, dass allein eine funktionsfähige Galactosidase gebildet wird. Bei lacZΔM15 fehlen in der Galactosidase die Aminosäuren 11 bis 41. Dadurch kann sie kein Homotetramer bilden; das Homotetramer ist die enzymatisch aktive Form.

Die lacZΔM15-Mutante wird auch ω-Peptid genannt. Sie kann durch ein Protein aus den Aminosäuren 1 bis 59 der Galactosidase ergänzt werden, das α-Peptid. Das Gen für dieses α-Peptid liegt auf dem Plasmid. Ist das lacZ-Gen auf dem Plasmid nicht durch ein Transgen unterbrochen, entsteht durch diese Ergänzung eine funktionsfähige Galactosidase.

Die Galactosidase ist eine Glycosidase. Sie spaltet den gelben Farbstoff X-Gal in einen blauen, unlöslichen Farbstoff, 5,5'-Dibromo-4,4'-Dichloro-Indigo, und Galactose. Die Expression von lacZ wird durch einen Promotor gesteuert und durch einen Induktor ausgelöst, zum Beispiel Lactose, Allolactose oder IPTG; IPTG wird im Artikel als stärkster bekannter Induktor genannt. Der Lac-Repressor LacI gibt durch Bindung des Induktors das Gen für die Genexpression frei. Bei X-Gal im Kulturmedium entsteht etwa eine Stunde nach der Induktion in Bakterien mit funktionsfähiger Galactosidase ein blauer Farbstoff. Transgene Organismen mit inaktivierter Galactosidase bleiben ungefärbt und können an der fehlenden Färbung isoliert werden.

Da der Import von Lactose über die Lactosepermease, das Gen lacY, durch Glucose gehemmt wird, sollte das Kulturmedium keine Glucose enthalten.

Grenzen und Kontrolle

Die Blau-Weiß-Selektion ist keine endgültige Bestätigung für das gewünschte Klonierungsergebnis. Nicht jede weiße Kolonie ist tatsächlich ein transgener Organismus, zum Beispiel kann LacZ auch durch DNA-Reparatur nicht ligierter Plasmide inaktiviert werden. Außerdem enthält nicht jeder transgene Organismus unbedingt das gewünschte zu klonierende Gen; es können auch andere DNA-Fragmente eingefügt sein.

Auch die Antibiotikaselektion kann fehlerhaft sein: Wenn zu wenig Antibiotikum verwendet wird oder die Kulturmedien zu alt sind, können weiße Kolonien ohne Plasmid wachsen. Deshalb folgt eine weitere Analyse, zum Beispiel per Polymerasekettenreaktion, meistens als Kolonie-Polymerasekettenreaktion, oder per DNA-Extraktion mit Restriktionsverdau. Beide Verfahren werden anschließend mit Agarose-Gelelektrophorese ausgewertet. X-Gal ist lichtempfindlich; der Farbstoff und X-Gal-haltige Agarplatten werden deshalb im Dunkeln aufbewahrt.

Entwicklung der Methode

Die Blau-Weiß-Selektion wurde zuerst in Komplementationsversuchen verwendet. Dabei sollte durch Einfügen eines zuvor entfernten DNA-Stücks die Funktion der Galactosidase wiederhergestellt werden.

Für Klonierungszwecke wurde die Blau-Weiß-Selektion erstmals in pUC-Plasmiden eingesetzt, zum Beispiel in pUC19.