PCR: Ablauf, Primer und Auswertung einfach erklärt

Ist von einem DNA-Abschnitt zu wenig Material vorhanden, erzeugt die PCR viele Kopien davon. Zwei passende Primer begrenzen den ausgewählten Bereich. Für die Reaktion brauchst du eine DNA-Probe mit dem Zielabschnitt als Vorlage, zwei unterschiedliche Primer als Startpunkte und freie Nukleotide mit Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin als Bausteine. Dazu kommen eine hitzestabile DNA-Polymerase, oft Taq-Polymerase, Puffer und Magnesium-Ionen für geeignete Bedingungen sowie ein Thermocycler für den Temperaturwechsel.

Taq-Polymerase stammt ursprünglich aus dem wärmeliebenden Bakterium Thermus aquaticus. Ihre Hitzestabilität ist wichtig, weil die Reaktion wiederholt stark erhitzt wird.

Ein PCR-Zyklus hat drei Schritte. Die genauen Temperaturen hängen unter anderem von Primern und Polymerase ab. Bei der Denaturierung (typisch etwa 94–96 °C) trennen sich die DNA-Stränge, weil Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen gelöst werden. Bei der Primerhybridisierung (etwa 50–65 °C, auch Annealing) binden die Primer beim Abkühlen an passende Stellen. Bei der Elongation (etwa 68–72 °C) verlängert die Polymerase die gebundenen Primer. Sie fügt passende Nukleotide an deren 3′-Ende an; der neue Strang wächst in 5′→3′-Richtung.

Ein Primer ist ein kurzer künstlich hergestellter DNA-Einzelstrang. Seine Basenfolge muss zur Bindestelle komplementär sein. Die beiden Vorlagenstränge sind entgegengesetzt orientiert und brauchen deshalb zwei unterschiedliche Primer. Die Polymerase beginnt nicht frei an einer beliebigen Stelle, sondern verlängert einen gebundenen Primer. Die Primer zeigen auf den Abschnitt zwischen ihnen. Für einen gezielten Entwurf müssen die Sequenzen an dessen Grenzen bekannt sein. Ungeeignete Primer oder Bindebedingungen können fehlende oder zusätzliche unerwünschte Produkte verursachen.

Die Produkte eines Zyklus dienen im nächsten Zyklus selbst als Vorlagen. Wenn jedes passende DNA-Molekül in jedem Zyklus vollständig verdoppelt wird, gilt für ein Ausgangsmolekül das Idealmodell N = 2^n. Dabei ist n die Zyklenzahl und N die Zahl der DNA-Doppelstränge. Nach vier Zyklen wären es 16; nach 30 Zyklen rechnerisch 1.073.741.824, also etwa 1,07 Milliarden.

Das Modell setzt vollständige Verdopplung in jedem Zyklus voraus. In der Praxis begrenzen Reaktionsbedingungen und Effizienz die Ausbeute; 2^n ist keine Garantie für eine tatsächlich gemessene Molekülzahl.

Viele Kopien allein sind noch keine Auswertung. Ein Agarosegel kann PCR-Fragmente nach ihrer Länge trennen: Negativ geladene DNA wandert zum Pluspol, kürzere Fragmente gelangen im selben Gel weiter. Eine Bande zeigt eine Fragmentlänge an, bestimmt aber für sich allein weder die gesamte Probe noch deren Herkunft. qPCR misst während der Zyklen ein Fluoreszenzsignal der entstehenden DNA. Soll RNA untersucht werden, schreibt bei der RT-PCR eine Reverse Transkriptase sie zunächst in komplementäre DNA (cDNA) um. Erst danach vervielfältigt PCR die cDNA.

Eine Positivkontrolle enthält den Zielabschnitt und sollte ein Signal liefern; bleibt es aus, kann die Reaktion fehlerhaft sein. Eine Negativkontrolle enthält keinen Zielabschnitt und sollte kein Zielsignal zeigen; ein Signal dort verlangt die Prüfung auf Verunreinigung oder unspezifische Reaktion. Ein Probensignal ist nur mit passenden Kontrollen und zur gestellten Frage deutbar.

PCR dient etwa der Erregerdiagnostik, der Untersuchung von Erbkrankheiten, Forensik, Verwandtschafts- und Evolutionsforschung sowie der Vorbereitung von Sequenzierungen und gentechnischen Schritten. Sie kopiert nur den durch Primer ausgewählten Bereich, nicht das ganze Genom. Gezielte Primer brauchen bekannte Binderegionen. Ungewollte Fragmente können entstehen und bei Bedarf mit einem Gel nach Länge getrennt werden. Ein Signal zeigt den Zielabschnitt unter den Versuchsbedingungen; seine Bedeutung hängt von Frage, Kontrollen und Auswertung ab. Für die Länge eignet sich ein Gel, für die Produktmenge während der Reaktion qPCR. Auch bei vielen Zyklen bleibt 2^n nur das Modell vollständiger Verdopplung.