Zählkammer

Grundidee und Zweck

Eine Zählkammer, auch Hämozytometer genannt, ist ein Hilfsmittel zur lichtmikroskopischen Zählung kleiner Teilchen in einer Teilchensuspension. Sie wird besonders in Medizin und Biologie eingesetzt, um Zellen wie Erythrozyten und Leukozyten oder Mikroorganismen zu quantifizieren.

Das Grundprinzip ist ein Raum mit genau bekanntem Volumen. Dieser Raum liegt zwischen einer Grundplatte aus Glas und einem darüberliegenden Deckglas. Auf der Grundplatte markieren Linien eine bekannte Fläche; zusammen mit der Kammerhöhe, also dem Abstand zwischen Grundfläche und Deckglasunterseite, ergibt sich das Volumen. Wenn man nach dem Einbringen einer Teilchensuspension die Teilchen in diesem markierten Volumen zählt, kann daraus die Konzentration der Teilchen berechnet werden.

Aufbau der Kammer

Die Grundplatte besteht aus optischem Spezialglas und hat die Größe eines normalen Objektträgers für Durchlichtmikroskopie: 76 mm × 26 mm nach DIN ISO 8037–1. Sie ist jedoch etwa 5 mm dick. Durch eingefräste Nuten wird ihre Oberfläche in zwei breite äußere Felder und drei schmale innere Stege geteilt. Die äußeren Felder dienen der Beschriftung. Die inneren Stege sind plangeschliffen und poliert.

Der mittlere Steg bildet den Kammerboden. Er liegt normalerweise 0,1 mm tiefer als die beiden seitlichen Trägerstege, auf denen das Deckglas aufliegt. Für sehr kleine Partikel, zum Beispiel Bakterien, beträgt die Kammertiefe nur 0,02 mm. In den Kammerboden ist ein Liniennetz eingraviert, das Zählnetz oder die Zählfläche. Meist gibt es zwei Zählnetze, die durch eine Nut getrennt sind.

Die speziellen Deckgläser für Zählkammern sind plangeschliffen und poliert. Sie sind dicker als normale Deckgläser, damit sie sich durch Kapillarkräfte nicht durchbiegen. Je nach Zählkammer-Typ haben sie die Maße 24 mm × 24 mm, 20 mm × 26 mm oder 22 mm × 30 mm, jeweils mit einer Dicke von 0,4 mm.

Vorbereitung, Befüllung und Reinigung

Vor dem Gebrauch soll die Kammer möglichst frei von Staub, Fusseln und Zellen sein. Das Deckglas wird im Querformat mit etwas Druck auf die beiden Trägerstege geschoben; dabei besteht Bruchgefahr. Sitzt es richtig, sieht man Newtonsche Interferenzfarben. Diese zeigen, dass der Abstand zwischen Trägerstegen und Deckglas in der Größenordnung der Lichtwellenlängen liegt und praktisch vernachlässigbar ist. Dann verrutscht das Deckglas auch beim Kippen der Kammer nicht.

Zur Beschickung wird die auszuzählende Teilchensuspension bei aufgelegtem Deckglas seitlich aufpipettiert. Durch Kapillarkraft zieht sie sich in den Zwischenraum und bildet eine Schicht mit genau bekannter Dicke. Nach der mikroskopischen Auszählung der Teilchen auf den Zählfeldern kann die Teilchenzahl pro Volumeneinheit berechnet werden. Bei Zellen können Anfärbung oder Phasenkontrastmikroskopie helfen, sie besser zu erkennen.

Nach der Benutzung werden Kammer und Deckglas vorsichtig mit einem fusselfreien Einmaltuch von der Suspension befreit, mit 70-prozentigem 2-Propanol oder einem ähnlichen Desinfektionsmittel gereinigt und getrocknet. Besonders das Deckglas muss vorsichtig behandelt werden, weil es plangeschliffen und deutlich teurer als ein normales Deckglas ist.

Zählregeln und Berechnung

Je nach Teilchentyp werden bestimmte Großquadrate oder Gruppenquadrate ausgezählt. Aus mehreren gezählten Feldern bildet man einen Mittelwert. Dieser Mittelwert wird mit einem passenden Faktor multipliziert. Der Faktor ist der Kehrwert des Produkts aus Quadratfläche und Kammerhöhe. So erhält man die Teilchenzahl pro Volumeneinheit.

Wichtig ist, Teilchen auf Grenzlinien nicht doppelt zu zählen. Üblich ist deshalb, bei einem Quadrat nur die Teilchen auf zwei Grenzlinien mitzuzählen, zum Beispiel oben und links, und die Teilchen auf den anderen beiden Linien nicht mitzuzählen.

Vor der eigentlichen Auszählung soll man das gesamte Linienraster bei geringer Vergrößerung betrachten. Dabei prüft man, ob die Teilchen einigermaßen gleichmäßig über die Quadrate verteilt sind. Ist die Verteilung ungleichmäßig, sollte die Suspension nochmals aufgeschüttelt und neu aufgebracht werden. Eine ungleichmäßige Verteilung erkennt man auch daran, dass mehrere Quadrate stark unterschiedliche Teilchenzahlen ergeben. Bei sehr geringer Teilchendichte müssen viele Quadrate gezählt werden; bei hoher Teilchenkonzentration, etwa bei Hefesuspensionen, muss die Probe verdünnt werden. Angestrebt wird etwa 1 Teilchen pro kleines Quadrat.

Beispiele für Blutzellzählungen

Bei der Leukozytenzählung werden 4 große Eckquadrate ausgezählt. Die Gesamtzahl wird durch 4 geteilt, um den Mittelwert pro Eckquadrat zu erhalten. Dieser Wert wird mit 10 multipliziert; das Ergebnis ist die Anzahl der Zellen je µl. Der Faktor 10 ergibt sich daraus, dass jedes Eckquadrat 1 mm² Fläche hat und die Kammerhöhe 0,1 mm beträgt. Ein Eckquadrat entspricht also einem Volumen von 0,1 µl beziehungsweise 0,1 mm³. Eine vorher vorgenommene Verdünnung muss zusätzlich berücksichtigt werden.

Bei der Erythrozytenzählung, auch für kleinere Zellen wie CHO-Zellen in Zellkulturen, werden viermal 5 Gruppenquadrate ausgezählt. Daraus wird der Mittelwert für 5 Gruppenquadrate ermittelt. Diese Zahl wird mit 50 multipliziert, um die Zellzahl pro µl zu erhalten. Die Rechnung beruht auf 1 / (5 × 0,04 mm² × 0,1 mm) = 50. Auch hier muss eine vorherige Verdünnung berücksichtigt werden.

Wichtige Zählkammertypen

Zählkammertypen unterscheiden sich vor allem durch die Art ihres Zählgitters. Die Neubauer-Zählkammer besitzt ein Zählgitter aus 3 × 3 Großquadraten mit je 1 mm Kantenlänge und je 1 mm² Fläche. Bei der Neubauer improved ist das zentrale Großquadrat in 5 × 5 Gruppenquadrate mit je 0,2 mm Kantenlänge unterteilt; ein Gruppenquadrat hat damit 0,04 mm². Jedes Gruppenquadrat ist nochmals in 4 × 4 Kleinstquadrate mit je 0,05 mm Kantenlänge und je 0,0025 mm² Fläche eingeteilt. Eine Besonderheit sind die dreifachen Begrenzungslinien der Gruppenquadrate; die mittlere Linie ist die eigentliche Begrenzung.

Bei der alten Neubauer-Zählkammer, die der Thoma-Zählkammer entspricht, ist das mittlere Großquadrat in 4 × 4 Gruppenquadrate von ebenfalls 0,2 mm Kantenlänge unterteilt. Die Begrenzungsregeln der dreifachen Linien unterscheiden sich von der Neubauer improved.

Weitere Modelle sind unter anderem Thoma, Türk, Bürker, Bürker-Türk, Fuchs-Rosenthal, Malassez, McMaster, Nageotte, Petroff-Hausser und Schilling. Sie unterscheiden sich durch Fläche, Unterteilung, Kammertiefe und typische Anwendungen. Fuchs-Rosenthal hat zum Beispiel ein großes Zählnetz von 16 mm² und wird unter anderem für Zellzählungen im Liquor eingesetzt. Malassez bedeckt 5 mm² und wird ebenfalls für Liquor oder Nematoden genannt. McMaster dient mit etwa 127 mm × 26 mm und etwa 1,5 mm Tiefe der Zählung von Wurmeiern. Petroff-Hausser hat eine Tiefe von 0,02 mm und wird zum Zählen von Bakterien, Blutplättchen, Spermien und ähnlichen Teilchen verwendet.