RACE-PCR

Grundprinzip und Bedeutung

RACE beziehungsweise RACE-PCR („rapid amplification of cDNA-ends“) bezeichnet in der Molekularbiologie Methoden, mit denen cDNA-Enden mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) schnell vervielfältigt werden. Meist ist sie eine Form oder Abwandlung der RT-PCR: RNA wird zunächst durch eine Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben und diese anschließend per PCR amplifiziert.

Mit RACE lassen sich die Enden eines Gens beziehungsweise die Enden seines mRNA-Transkripts erfassen. Die codierende Sequenz ist aus der Genom-DNA oft anhand offener Leserahmen erkennbar. Die untranslatierten Regionen (UTRs) an beiden Enden lassen sich jedoch nicht unmittelbar aus der Genomsequenz ableiten. Sie enthalten regulatorische Elemente, welche die Translation der mRNA und ihre Stabilität beeinflussen.

Aus einer kurzen bekannten Sequenz, etwa aus der codierenden Region, kann entweder das 3'-Ende mittels 3'-RACE-PCR oder das 5'-Ende mittels 5'-RACE-PCR untersucht werden. Beide beruhen auf cDNA-Synthese und PCR. Je länger der noch unbekannte Bereich ist, desto anspruchsvoller wird die Methode; dies kann die Untersuchung von 3'-UTR und 5'-UTR unterschiedlich schwierig machen.

Untersuchung des 3'-Endes

Eukaryotische mRNAs besitzen am 3'-Ende einen Poly(A)-Schwanz. Dieser dient bei der 3'-RACE als Ansatzpunkt. In der ursprünglichen Methode von Frohman et al. (1988) enthält ein Adapter-Primer zwei Bereiche: 17 Thymin-Basen, die komplementär an den Poly(A)-Schwanz binden, und einen zusätzlichen Bereich mit 18 Basen für spätere PCR und Klonierung.

Der Primer bindet an die mRNA, und die Reverse Transkriptase synthetisiert von dort Erststrang-cDNA. Anschließend wird mit einem genspezifischen Primer, der an einem bekannten Bereich der entstandenen cDNA bindet, und dem Adapter-Primer PCR durchgeführt. Das Produkt ist doppelsträngige cDNA mit definierten Enden und kann beispielsweise kloniert und sequenziert werden.

Bei der klassischen Darstellung bindet ein Ankerprimer mit Oligo(dT)- und Adapter-Sequenz innerhalb des Poly(A)-Schwanzes. Nach der cDNA-Synthese bindet zunächst ein genspezifischer Primer. In einer ersten PCR werden passende Erststrang-cDNAs ergänzt und danach mit genspezifischem sowie Adapter-Sequenz-Primer amplifiziert. Weil eine PCR mit nur einem genspezifischen Primer mehr unerwünschte Produkte erzeugen kann, folgt häufig eine zweite PCR mit verschachtelten (nested) Primern. Diese liegen innerhalb des ersten Produkts, erhöhen die Spezifität und erzeugen ein kürzeres Produkt. Verbleibende Adaptersequenzen können Endorestriktase-Schnittstellen für die Klonierung enthalten.

Verbesserungen umfassen den lock-docking oligo(dT) primer, der möglichst am Übergang vom transkribierten Bereich zum Poly(A)-Schwanz, also am Ende des 3'-UTR, binden soll. Zwei PCR-Serien mit verschachtelten Primern steigern die Spezifität. Ein zusätzlicher RNA-Abbau durch Hydrolyse oder RNase H und RNase A verbesserte die anschließende PCR-Amplifikation dagegen nur selten.

Klassische Untersuchung des 5'-Endes

Am 5'-Ende der eukaryotischen mRNA gibt es keine dem Poly(A)-Schwanz entsprechende Struktur. Daher wurde bei den ersten 5'-RACE-Anwendungen von Frohman et al. (1988) nach der Erststrang-cDNA-Synthese künstlich eine Polyadenylierung erzeugt.

Zuerst bindet ein genspezifischer Primer (5RT) an die RNA und ermöglicht die reverse Transkription in Richtung des 5'-Endes. Nach Entfernung überschüssigen Primers verlängert die Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) das 3'-Ende der einzelsträngigen cDNA, das dem 5'-Ende des Gens entspricht, mit Adenin-Basen. Ein (dT)₁₇-adaptor primer bindet an diesen künstlichen Poly(A)-Anker, leitet die Zweitstrang-Synthese ein und enthält eine Adaptorsequenz. Danach amplifizieren ein genspezifischer Primer (5'amp) und ein Adapter-Primer die cDNA per PCR. Das Produkt kann unter anderem kloniert und sequenziert werden.

Diese Variante heißt auch klassische 5'-RACE. Statt eines Poly(dA)-Ankers kann ein Poly(dC)-Anker verwendet werden: Die Bindung eines Oligo-(dG)-Primers an Poly(dC) ist stärker als die eines Oligo-(dT)-Primers an Poly(dA). Die Bindungsstärke kann außerdem durch dI-Bausteine (Desoxyinosinmonophosphat) neben dG-Bausteinen verändert werden. Vor der TdT-Behandlung wurde eine RNAse-Behandlung empfohlen.

Weitere 5'-RACE-Ansätze nutzen die Cap-Struktur am 5'-Ende eukaryotischer mRNA, um eine Ankersequenz zu ligieren oder die Reverse Transkriptase über das mRNA-Ende hinaus verlängern zu lassen. Bei cRACE werden dagegen Nukleinsäuremoleküle ringförmig geschlossen; dann ist keine zusätzliche Struktur am Ende nötig.

Adapterligation an das 5'-Ende

Bei der RLM-RACE („RNA ligase mediated RACE“) fügt eine Ligase einzelne Nukleinsäurestränge zusammen. Die Originalarbeit beschrieb Varianten für 3'- und 5'-Enden; für das 5'-Ende wird zunächst die Cap-Struktur der mRNA mit Natriumperiodat chemisch entfernt. Dadurch liegen am 5'-Ende mehr als eine Phosphatgruppe vor. Diese werden mit alkalischer Phosphatase, der calf intestine phosphatase (CIP), entfernt.

Da für die folgende Ligation genau eine Phosphatgruppe benötigt wird, setzt man T4-Polynukleotidkinase ein. T4-RNA-Ligase fügt dann kurze RNA-Oligonukleotide einheitlicher Sequenz an die 5'-Enden der mRNAs an. Die so veränderte mRNA wird mit zufälligen DNA-Hexameren als Primern in Erststrang-cDNA umgeschrieben. Die cDNA trägt am 3'-Ende die einheitliche Sequenz, die durch die zuvor ligierten RNA-Oligonukleotide entstanden ist. Eine Zweitstrang-Synthese ist nicht nötig: Die PCR kann mit einem einheitlichen und einem genspezifischen Primer erfolgen.

Cap- und Template-Switching-Verfahren

Oligo-capping wurde 1994 von K. Maruyama und S. Sugano vorgestellt und ähnelt der 1993 von X. Liu und M. A. Gorovsky beschriebenen RLM-RACE. Beide Verfahren ligieren einheitliche künstliche RNA-Oligonukleotide an RNA-5'-Enden, die die Cap-Struktur ersetzen sollen. Sie unterscheiden sich unter anderem darin, wie die Cap-Struktur entfernt wird sowie in Zahl und Reihenfolge der Schritte.

Oligo-capping dient zur Untersuchung des vollständigen 5'-Endes der cDNA. Zunächst dephosphoryliert bacterial alkaline phosphatase (BAP) RNA-Bruchstücke mit freien 5'-Phosphatenden; durch Capping geschützte mRNAs bleiben erhalten. Danach entfernt tobacco acid pyrophosphatase (TAP) die Caps, während das 5'-α-Phosphat erhalten bleibt. T4-RNA-Ligase fügt ein RNA-Adapter-Oligonukleotid bekannter Sequenz an. Nach cDNA-Synthese mit einem Antisense-Primer folgt PCR mit diesem Primer und dem Adapter-Primer.

SMART-RACE nutzt den zunächst von Clontech Laboratories (Inc.) verwendeten Handelsnamen SMART™ („switching mechanism at 5' end of RNA transcript“); Vorläufer war CapFinder™. Die gesamte mRNA wird von einem Oligo(dT)-Primer aus in cDNA umgeschrieben. Gegenüber der Cap-Struktur fügt die Reverse Transkriptase an das 3'-Ende der cDNA eine kurze, zunächst ungepaarte Oligo(dC)-Sequenz an. Ein Ankerprimer mit komplementärer Oligo(dG)-Struktur ermöglicht den Wechsel der Reverse Transkriptase von der mRNA-Vorlage zum Ankerprimer. Die einzelsträngige cDNA besitzt dadurch an beiden Enden spezifische, für die anschließende RACE-PCR geeignete Sequenzen.

Zirkularisierte cDNA

cRACE ist eine 5'-RACE-Methode, bei der die Enden der zuerst gebildeten cDNA miteinander ligiert werden. Dadurch entsteht ein zirkuläres cDNA-Molekül. Die Bezeichnung bedeutet „circular or concatemeric first-strand cDNA-mediated RACE“; die Methode wurde von Maruyama et al. (1995) veröffentlicht.

Ein genspezifischer Primer wird zuerst mit T4-Polynukleotidkinase am 5'-Ende phosphoryliert. Er bindet an die mRNA, und eine Reverse Transkriptase synthetisiert Erststrang-cDNA. Anschließend wird die RNA alkalisch hydrolysiert und die einzelsträngige, genspezifische cDNA mit Ethanol gefällt. Nach dem Wiederlösen verknüpft T4-RNA-Ligase ihre Enden zu einem Ring. Zwei weitere genspezifische Primer, die stromaufwärts des zuerst verwendeten Primers binden, amplifizieren die zirkuläre cDNA per PCR; auch verschachtelte PCRs sind möglich.

Ein möglicher großer Vorteil gegenüber anderen RACE-Varianten ist, dass für sämtliche Schritte nur genspezifische Primer und keine Ankerprimer benötigt werden. Die Idee der Zirkularisierung einzelsträngiger cDNA beruht auf einer zuvor entwickelten Methode von Mandl et al. (1991), bei der aufwändig behandelte mRNA-Moleküle an ihren Enden verknüpft wurden.