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Neue Modelle zur Infektiositätstestung humaner Noroviren – Von Stammzellen bis Zebrafisch
Das Wichtigste aus dem Video
Tipp auf eine Zeit – das Video springt genau dorthin.
Transkriptautomatisch erstellt · 224 Zeilen
- Dann gehen wir jetzt weiter. Den letzten Vortrag in dieser Session hält Stefan Taube aus Lübeck.
- Und er stellt uns neue Modelle zur Infektionstestung von Noroviren vor. Wir bleiben also beim Virus.
- Wie sind wir denn in der Zeit? Sehr gut.
- Ganz herzlichen Dank für die Einladung. Ich freue mich, dass ich hier bin und das waren
- sehr viele spannende und anregende Vorträge soweit. Und vielleicht ergeben sich ja jetzt
- nach diesem auch noch ein paar neue Gespräche. Ich möchte ein bisschen was erzählen zu neuen Modellen in der Infektionstestung
- humaner Noroviren – von Stammzellen bis zum Zebrafisch. Diejenigen, die sich vielleicht
- mit Norovirusinfektiosität und Zellkulturen beschäftigen, haben ja vielleicht mitgekriegt, dass es sehr viele neue Modelle gibt.
- Und ich versuche Ihnen heute das eine oder andere vorzustellen und die Vor- und
- Nachteile ein bisschen zu erörtern. Eine große Einführung muss ich gar nicht geben,
- wir haben ja schon viel gehört. Albert Kapikian
- wurde heute auch schon gezeigt. Und ja, wir haben eine Gastroenteritis.
- Es gibt keine antivirale Behandlung für Noroviren. Das ist auch etwas, woran wir arbeiten
- bei uns im Labor in Lübeck. Und derzeit auch noch keinen lizensiertes
- Vakzin, obwohl dort schon mehrere monovalente und polyvalente Vakzine in Clinical Trials sind.
- Auch bei der Klassifikation der Noroviren hat sich in den letzten Jahren ein bisschen was geändert und eine ähnliche Folie
- hatten wir ja auch schon gesehen. Es gibt zum einen das Polymerase Typing in der RNA
- abhängigen Polymerase und das Kapsid Typing im Kapsidprotein.
- Für mich ist insbesondere
- die Kapsid-Typisierung wichtig, weil das Kapsid der Hauptträger des Tropismus, des Virus ist
- und damit die Wirts- und Gewebsspezifität einhergeht.
- Was jetzt bei der Polymerase, da kann es das natürlich bis zu einem gewissen Grad auch geben, aber der Hauptträger
- ist auf jeden Fall das Kapsid hier. Noroviren sind mittlerweile in 10 Genogruppen
- unterteilt, basierend auf der Aminosäure-Sequenz des Kapsidproteins. Und wenn man jetzt mal in diese neue Einteilung
- ein bisschen reingeht, haben wir jetzt mehrere Norovirus-Genotypen, die auch Menschen infizieren.
- Genogruppe I, II und IV sind die alten Genotypen. Und jetzt sind noch zwei weitere dazugekommen:
- Genotyp VIII und Genotyp IX. Wenn es jetzt dahin geht, zu überlegen, welche neuen Zellkulturmodelle
- oder Tiermodell wir verwenden können, um Noroviren zu untersuchen, dann ist es
- natürlich interessant, wenn wir Noroviren finden, die natürlich einen bestimmten Wirt haben, für das wir auch ein Labormodell haben.
- Und wenn wir hier gucken, dann fallen ein paar Tiere auf.
- Hund: Genotyp VI und VII. Die Rinder: Genotyp III,
- auch Schaf in der Genogruppe. Neu dazugekommen: in der Genogruppe X gibt es sogar einen Fledermaus-Norovirus.
- Und für mich besonders interessant ist natürlich die Genogruppe V mit Mäusen,
- weil wir da eine große Auswahl an Tierversuchen machen können.
- Genogruppe II und IV sind interessant, weil wir hier sowohl Mensch als auch Tier in der gleichen Genogruppe haben.
- Jetzt könnte man sich denken, sind Noroviren zoonotisch, spielt das eine Rolle? Ich kann die Frage so derzeit nicht beantworten.
- Es gibt Hinweise darauf, dass es zoonotische Übertragung gibt, aber meines Wissens ist das noch nicht wirklich kausal belegt,
- dass das Norovirus von einem Menschen auf ein Tier geht und dort eine Erkrankung stattfindet und umgekehrt.
- Was auch auffällt ist, wenn man in die Genogruppen reinguckt und sich die Genotypen anguckt, hat man bei den Tieren
- oft unterschiedliche Genotypen in der gleichen Genogruppe, die dann spezifisch sind. Also wir haben hier zum Beispiel beim...
- bei der Genogruppe II haben wir die meisten humanen, aber Genotyp GII. 11, GII. 18 und GII. 19
- sind die, die dann vorwiegend in Schweinen gefunden werden. Was darauf hindeutet, dass es da
- eine gewisse Tropismus-Barriere gibt. So, wir haben jetzt verschiedene Tiere.
- Das einzige Norovirus, das wir wirklich in Zellkultur anzüchten können, effektiv zumindest, sind Noroviren der Genogruppe V
- und das ist das Murine Norovirus. Und viele die sich mit Desinfektionsmitteltestung oder Nachweis
- in Lebensmitteln beschäftigen, benutzen sehr gerne das Maus-Norovirus als Surrogat-Virus. Ich kann aber sagen, dass die Eigenschaften von Maus- und humanen Norovirus
- nicht unbedingt immer die gleichen sind. Und je besser die Modelle werden, desto
- interessanter wird es auch dahin zu kommen, dass man auch humane Noroviren direkt
- in solchen Versuchen einsetzen kann. Genau.
- Bei den humanen Noroviren habe ich die Zellkultur noch nicht ganz so kräftig dargestellt,
- weil da noch sehr viele Hürden zu überwinden sind. Und da werde ich gleich noch ein bisschen drauf eingehen.
- Zunächst möchte ich noch ganz kurz ein bisschen die Grundlagen
- oder die Faktoren des Wirtstropismus ein bisschen darlegen und hier aus einer Virologievorlesung:
- Wir haben die Anknüpfungsrezeptoren, das sind gerne Kohlenhydrate auf der Zelloberfläche, wo das Virus erst mal andockt,
- und dann gibt es eine rezeptorvermittelte Endozytose, wo das Virus in die Zelle eintritt.
- Bei den Murinen Noroviren ist der Prozess sehr gut verstanden. Wir haben bestimmte Zucker,
- gerne auf Lipiden, an der Oberfläche, wo das Virus erst mal lose andocken kann. Und vor kurzem, 2016, identifiziert
- ist der bona fide entry receptor für Murine Noroviren, das mCD300LF.
- Dieser Rezeptor ist sehr wichtig und er ist für die Murinen Noroviren der Hauptfaktor
- für die Zell-, Wirts- und Species Spezifität. In unserem Labor haben wir mittlerweile Zelllinien gemacht
- mit einem Lentivirus-System, mit dem mCD300LF Rezeptor, die wir transduziert haben und haben jetzt zum Beispiel
- eine HuH7 Zelllinien, die wir wunderbar mit Murinen Noroviren infizieren können. Das erleichtert uns bestimmte Assays,
- weil die Zellen deutlich leichter zu händeln sind als andere Zelllinien, die für Murine Noroviren verwendet werden.
- Und die Infektionstestung, wie Plaque Assay, funktionieren mit diesen Zellen deutlich einfacher, reproduzierbarer und besser.
- Wenn jemand Interesse hat, können Sie mich gerne ansprechen. Den Rezeptor findet man vorwiegend auf Immunzellen,
- Makrophagen, dendritischen Zellen, monozytäre Zellen. Es gibt ein paar Epithelzellen,
- die den Rezeptor auch tragen und diese können infiziert werden.
- Bei den humanen Noroviren ist das Ganze ein bisschen anders. Hier haben wir einen Rezeptor,
- einen Glykan, ein Kohlenhydrat auf der Zelloberfläche. Was ein,
- wir nennen es einen Restriktionsfaktor ist. Wenn er nicht da ist, können wir die Zellen nicht infizieren.
- Aber wenn er da ist, reicht es auch nicht aus. Also eher etwas, was nicht fehlen darf.
- Und der Proteinrezeptor, wenn es ihn denn gibt, ist für humane Noroviren nicht bekannt.
- Aus einer kürzlich veröffentlichten Studie aus Kim Greens Lab vom NIH
- verdichten sich die Beweise, dass enteroendokrine Zellen,
- also spezifische Epithel-Subtyp-Zellen im Darm, die Zelllinien sind, die humanen Noroviren
- aktiv infizieren können. Und das könnte natürlich auch erklären, warum das so schwierig ist oder
- bisher war humane Noroviren effizient in Zellkultur anzuzüchten, weil das wirklich ein sehr spezifischer Subtyp ist.
- Und wenn man sich das Darmepithel anguckt, kommt der auch gar nicht so häufig vor. Die Kohlenhydrate,
- nur ganz kurz, dass Sie es einmal gesehen haben, Histo Blood-Group Antigens sind Kohlenhydratketten, die man von den Blutgruppen her kennt.
- Sie werden über Glycosyltransferase, es werden Zuckerketten aufeinander aufgebaut und es gibt ein Enzym, die alpha-(1,2)-Fucosyltransferase,
- die den sogenannten Sekretor-Phänotyp darstellt, der ein genetischer Faktor für die Suszeptibilität
- vieler humaner Norovirusinfektionen ist. Und die gleichen Zuckerstrukturen
- finden sich auch auf den Epithelzellen. Okay, das war eine kurze Einleitung,
- bevor ich zu den Modellsystemen komme. Wir haben gesehen, dass Noroviren verschiedene Säugetiere, eine Fledermaus ist
- auch ein Säugetier, das musste ich auch nachgucken, infizieren kann, dass wir hier eine Genotyp-Spezifität haben,
- Murine Noroviren die einzigen sind, die effizient bisher in Zellkultur wachsen.
- Blutgruppen Antigene HBGA sind so ein Link zu einer klinischen Relevanz. Wenn wir so was in einem Modell- oder Zellkultursystem sehen,
- haben wir etwas, wo wir sagen können, das passt zu dem Wildtyp-Virus, was wir in der Epidemiologie sehen.
- Murine Noroviren infizieren also Immunzellen, haben einen bekannten Rezeptor und humane Noroviren spezialisierte Epithelzellen, aber der Entry-Rezeptor ist noch nicht bekannt.
- Aber auch hier gibt es Beweise, Indizien, dass
- bestimmte Immunzellen eventuell auch eine Rolle spielen können. Das sind die Modellsysteme, die ich Ihnen heute vorstellen möchte.
- Die ersten beiden nur ganz kurz und die beiden letzteren sind die interessanteren.
- Darauf werde ich dann etwas detaillierter eingehen. Das erste eigentlich mehr aus historischen Gründen.
- Das gnotobiotische Schwein war eines der ersten oder
- das erste Tiermodell für die Infektion humaner Noroviren. Hier konnten nur spezifische GII-Isolate verwendet werden.
- Es gab einen intestinalen Tropismus, aber es ist ein sehr aufwendiges, sehr teures
- Experiment und nichts, was man jetzt sinnvoll in der Lebensmittelindustrie zum Testen einsetzen könnte.
- Und selbst für die Grundlagenforschung ist das eigentlich zu aufwendig.
- Und es hat nicht wirklich Anklang gefunden, zumal auch die Reproduzierbarkeit mit verschiedenen Stühlen
- nicht besonders einfach ist. Decreased titer over passaging, also wenn man das Virus in diesem System
- vermehrt passagiert, kriegt man im Endeffekt nicht wirklich mehr Virus raus, dass man ein systematisches Experiment durchführen kann.
- Und das ist ein Grundproblem, das kann ich schon jetzt sagen, was wir mit allen Zellkultur- und Tiermodellen für humane Noroviren haben.
- Also man braucht immer noch einen Patienten, eine Patientenprobe.
- Also, praktischer Nutzen limitiert. Das nächste Tiermodell
- stammt noch aus meiner Postdoc Zeit. Wir haben uns ein bisschen an dem
- Murinen Norovirus lang gehangelt und haben gesehen, das infiziert Immunzellen. Was passiert denn, wenn wir jetzt einer Maus humane Immunzellen geben?
- Können wir die infizieren? Und da gibt es das humanisierte Mausmodell.
- Das haben wir verwendet und haben dann zu unserer Überraschung festgestellt, dass, hier ist das humane Mausmodell, Rag-Gamma-Chain Knockout-Mäuse.
- Hier haben wir die Rag-Gamma-Chain Controls und hier haben wir einen anderen Mausstamm, Balb/c Mäuse.
- Das unabhängig von der Humanisierung dieser immunsupprimierten Rag-Gamma-Chain Knockout Mäusen bei manchen Stuhlproben, vor allem GII,
- wir haben hier einen Mix verwendet, damit wir ein bisschen größeres Material haben, da wir hier ein bisschen
- Infektionen sehen konnten. Eine Passage war aber auch nicht möglich.
- Es kann auch sein, dass das eine abortive Infektion war, das heißt, man geht rein, infiziert und man hat vorwiegend
- RNA-Replikationen in den Zellen, aber wenig infektiöse Viren, die nachher rauskommt. Also Praktikabilität
- auch sehr eingeschränkt, zumal wir hier gerade mit immunsupprimierten Mäusen arbeiten,
- sodass Vakzine und ähnliche Testungen da auch nicht wirklich Sinn machen.
- Jetzt kommen wir zu den interessanten Modellen. Da haben wir einmal das Organoid-Modell,
- ein dreidimensionales Zellkulturmodell. Das wurde das erste Mal 2016 von Ettayebi
- in der Gruppe von Mary Estes aus den USA beschrieben. Dieses Modell haben wir jetzt bei uns auch im Labor und die Idee dahinter ist,
- dass man spezifische, eine Organoid-Struktur in vitro im Reagenzglas herstellen kann.
- Was man dazu braucht, ist erstmal eine Gewebeprobe. Die wird für Enteroide
- aus dem Dünndarm oder aus dem Dickdarm entnommen. Und hier wird natürlich auch darauf geachtet, dass der Spender genetisch
- kompatibel ist. Also hier geht man dann,
- sucht man sich einen Sekretor-positiven Spender. Man hat also eine Gewebeprobe und aus dieser Gewebeprobe werden
- intestinale Stammzellen extrahiert. Das haben wir mit Kollaboratoren
- in Michigan, an der Universität Michigan gemacht
- und haben aus verschiedenen Spendern, gesunden, aber auch inflammatorischen
- Bowel Disease Spendern haben wir Darm-Stammzellen entnommen und können diese unter speziellen Zellkulturbedingungen
- auch als Stammzellen weiter passagieren. Das ist jetzt keine Zellkultur in dem Sinne.
- Das sind Stammzellen, die sich im richtigen Medium, sehr teurem Medium, weiter passagieren lassen.
- Und die kann man natürlich infizieren und untersuchen. Diese Arbeiten hat Carmen Mirabelli gemacht,
- die ihren Postdoc in Michigan gemacht hat und zum Schluss auch bei mir im Labor gearbeitet hat.
- Sie hat diese Stammzellen im Endeffekt mitgebracht. So sieht das nachher aus in einem 6-well.
- Da werden diese Stammzellen in diesen weißen Kugeln, das ist eine Matrix,
- gezüchtet. Die müssen einzeln da rein pipettiert werden. Nicht die Stammzellen, sondern diese Kugeln.
- Und die werden dann mit der Zell-Suspension angeimpft. Und dann haben wir ein
- Medium, was erstmal diese Stammzell-Expansion möglich macht.
- Und wenn man dann infizieren möchte, wechselt man das Medium nach sechs Tagen. Also um dahin zu kommen, braucht man schon mal zwei Wochen.
- Dann folgt noch eine knappe Woche zur Differenzierung und dann haben wir so dreidimensionale Organoid-Strukturen
- mit verschiedenen Zell-Subtypen, die wir infizieren können.
- In der Original-Publikation musste das erst noch mal homogenisiert werden als als ein Layer.
- Wir infizieren mittlerweile direkt in diese Organoid-Strukturen und das funktioniert mittlerweile sogar besser als die
- adhärenten separierten Zellen. Hier ist nur noch mal gezeigt,
- dass wir hier auch die HBGA-Expression auf diesen Zellen haben. Genau. Die Ergebnisse,
- wir vergleichen im Endeffekt ist das immer eine PCR, Genomkopien, zwei Stunden nach Infektion
- gegenüber zwei Tagen nach Infektion und das waren die initialen Experimente
- hier von 10 hoch 4 auf 10 hoch 5, also 50-fach.
- Wenn man das etwas standardisierter macht, MOI, Multiplicity of Infection. Also, wir haben die Infektionsdosis pro Zelle
- von 5 auf 50 auf 500 Genome pro Zelle erhöht und sehen auch einen Anstieg
- der Genomkopien. Zwei Stunden, also praktisch unser Input gegenüber 10 hoch 6
- bis hin zu 10 hoch 8 Genomkopien. Und Sie sehen auch die Reproduzierbarkeit.
- Das ist eigentlich bisher das beste Modell, was wir haben, um infizieren zu können.
- Der Nachteil an der ganzen Geschichte, man braucht eine Stuhlprobe, die funktioniert.
- Also man kann nicht davon ausgehen, dass jede Stuhlprobe gleich funktioniert und Genomkopien heißt auch nicht infektiöses Virus.
- Wenn wir das mit MNV vergleichen, dann haben wir wahrscheinlich ein Verhältnis von 1000 Genomkopien zu einem infektiösen Virus.
- Das sollte man immer im Hinterkopf haben, gerade wenn man Verdünnungsreihungen macht für Infektionsversuche.
- Okay, dieses System zeigt, dass wir Epithelzellen
- im Darm infizieren können. Es wurde mit verschiedenen Genotypen wiederholt.
- Es ist in mehreren Laboren mittlerweile etabliert. Wir sehen, dass wir für humane Noroviren einen
- Epithelzell-Tropismus haben, der vermutlich auch biologisch relevant ist. Es ist immer noch ein sehr teures, sehr aufwendiges, nicht immer
- für jede Stuhlprobe reproduzierbares System. Und die Zellkulturen sind auch anfällig.
- Also man muss da schon sich langsam reinarbeiten. Auch hier haben wir das Problem, dass wir nicht in der Lage sind,
- so viel Virus zu produzieren, dass wir eine Stock Solution haben, mit der wir systematische Experimente durchführen können.
- Also, wenn Sie jetzt denken, ich kann meinen Salat waschen und das Virus auf meine Enteroide geben.
- Erstens wäre das sehr teuer und zweitens wäre das Virus wahrscheinlich so verdünnt, dass wir die Initialdosis,
- um das überhaupt starten zu können, gar nicht erreichen werden. Also da muss noch sehr viel passieren.
- Okay, dann kommen wir zu dem letzten System, was ich Ihnen vorstellen möchte.
- Und damit hätte jetzt wahrscheinlich auch keiner gerechnet, dass Fische, Zebrafische, die ja eigentlich eher aus der Entwicklungsbiologie
- interessant sind, eine Relevanz für humane Noroviren haben. Aber wenn man ein bisschen in die
- Literatur guckt, zeigt sich, dass Zebrafische für verschiedene Viren bereits als Infektionsmodell etabliert sind:
- Herpesviren, Influenza, Hepatitis C, Chikungunya. Also erst mal grundsätzlich interessant.
- Super einfach, Enteroide brauchen teure Medien.
- Die Dinger kann ich in Wasser packen. Das ist also sehr schön, sehr einfach und auch das Füttern
- ist wirklich einfach. Die Regenerationsrate ist drei Monate
- bis alle Organe, bis der Organismus also voll ausgereift ist, auch sehr schön. Also man kann
- damit sehr viele Experimente machen, man kann in die Organe reingucken usw. Interessanterweise sind Zebrafische
- in vielen Sachen Menschen sehr ähnlich. Sie haben ein funktionales Immunsystem, sie haben T-Zellen, sie haben B-Zellen,
- Makrophagen, Neutrophile. Und für uns interessant, sie haben sogar eine Fucosyltransferase, die unserer ähnlich ist,
- sodass wir da ähnliche Strukturen haben. Ein weiterer Vorteil vom Zebrafisch-System ist,
- das klingt erstmal nach Tiermodell, vielleicht sollte ich das noch erklären.
- Es handelt sich hier erst mal um Zebrafischlarven und solange diese nicht selbstständig
- Nahrung aufnehmen, ist das noch kein Tierversuch. Also das kann man wirklich im Labor auf der Bench machen.
- Es sind also sehr kleine Tierchen und die Infektion passiert durch Mikroinjektion.
- Und wir haben hier also eine Glaskapillare, die wir selber ziehen. Da kommt die Stuhl-Suspension rein und die wird in den Dottersack
- der Zebrafischlarve injiziert und wir injizieren 3 Nanoliter von unserer Stuhl-Suspension. Also
- eine Stuhlprobe, die ja meistens so ein bisschen Erbsen groß ist und für Experimente nicht so lange reicht.
- Hier haben wir zwar viel, was wir nachher wegschmeißen müssen,
- weil in der Kapillare was zurückbleibt, aber kein Verhältnis zu den Sachen, die wir normalerweise
- in Zellkultur einsetzen müssen. Genau.
- Also Tag 0, man züchtet 100 bis 200 Larven, packt zwei Fische in einen Tank,
- Morgens einmal das Gitter hoch und dann geht's los und dann kann man auch schon schnell die Larven ernten.
- Am Tag 2 sucht man sich dann immer Pools von zehn Larven.
- Das ist leider sehr zeit- und arbeitsaufwändig, weil man die Larven sedieren muss.
- Auf eine Agar-Matrix packen und dann einzeln anpiksen mit einem Mikroinjektor.
- Das ist dann etwas, was vielleicht auch nicht in jedem Labor zur Verfügung steht und auch nicht etwas, was man so einfach mal hoch skalieren kann.
- In der Regel werden 10 Larven nachher für eine Kondition, eine Behandlung, gepooled
- und es findet wieder eine RNA-Extraktion statt, eine Real-Time-PCR. Und ich habe nur ein Ergebnis jetzt
- hier mal mitgebracht, dass man sieht, also auch hier haben wir eine etwa 2 log-Stufen größere
- Vermehrung von Virus-Titern über 48 Stunden. Dieses System, ähnlich
- wie das Enteroid-System, ist mittlerweile von anderen Gruppen auch schon zur Drug-Testung verwendet worden.
- Also hier kann man Proteaseinhibitoren, Entry-Inhibitoren, usw. durchaus systematisch durchtesten.
- Also wir haben einen Fisch, der mit verschiedenen Genotypen infiziert werden kann.
- In dem Fisch haben wir auch einen intestinalen Tropismus. Die Methode ist
- arbeitsaufwendig, aber nicht teuer. Man braucht Fischkultur und Microinjektion-Equipment.
- Ein großer Vorteil ist die niedrige Infektionsdosis. Dadurch, dass man nicht so viel Material hat,
- ist es natürlich auch wieder schwierig, größere Mengen an Material zu gewinnen. Und wir sind jetzt dabei, das Zebrafisch-Modell mit dem Enteroid-Modell zu koppeln,
- dass wir gucken, das, was wir im Enteroid-Modell rauskriegen, im Zebrafisch weiter passagieren können.
- Bisher sind wir aber immer noch auf Patienten-Stuhlproben angewiesen
- und auch dieses System ist mittlerweile in verschiedenen Laboren etabliert.
- Die Person, die das entwickelt hat, ist Joana Rocha-Pereira in der Universität Leuven in Belgien.
- Und wir haben damit zusammengearbeitet. Okay, damit bin ich auch schon am Ende.
- Einen kleinen Vergleich noch zwischen den einzelnen Proben. Alle Modelle, die es gibt,
- brauchen immer noch eine Patienten-Probe. Das ist also das größte Hindernis, das es bisher zu
- überbrücken gilt. Alle Modelle sind
- arbeitsaufwendig, zum Teil teuer und keins davon kann wirklich ohne Weiteres hoch skaliert werden.
- Das heißt, auch da müssen wir noch ein bisschen warten. Es gibt
- ein neues System, was ich heute noch nicht vorgestellt habe, eine Publikation aus
- Amerika, die eine japanische Speichel-Zelllinien verwenden. Und das sieht sehr gut aus, dass das in Zukunft
- viel Arbeit abnehmen kann. Okay, die Modelle
- sind also limitiert auf spezifische Genotypen. Manche Modelle funktionieren nur mit bestimmten Genotypen.
- Einige Modelle haben das Nachempfinden des HBGA, der HBGA-Abhängigkeit
- und das ist natürlich für die Grundlagenforschung wichtig. Und vor allem Zebrafisch und Enteroide
- sind derzeit die akzeptierten und reproduzierbaren Modelle. Ja, damit bin ich am Ende.
- Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit und ich stehe für Fragen zur Verfügung.